一、技术概述

DNA 甲基化检测是分析基因组 DNA 中胞嘧啶（C）与鸟嘌呤（G）位点（CpG 位点）甲基化状态的技术，通过检测特定基因启动子或调控区域的甲基化水平，探究其对基因表达的调控作用。DNA 甲基化是表观遗传调控的核心机制之一，与细胞分化、肿瘤发生、遗传病发病等密切相关，其检测结果可为疾病诊断、预后评估及机制研究提供关键依据。

二、核心应用场景

肿瘤研究：检测抑癌基因启动子区甲基化（如 p16、BRCA1），用于肿瘤早期诊断、疗效监测及预后判断。

表观遗传调控机制：分析基因甲基化水平与表达量的关联性，探究环境因素（如药物、饮食）对基因调控的影响。

发育生物学：追踪胚胎发育过程中关键基因的甲基化动态变化，解析细胞分化的表观遗传调控网络。

疾病标志物筛选：在血液、组织样本中筛选特异性甲基化位点，开发疾病诊断的分子标志物（如癌症早期筛查的甲基化面板）。

药物研发：评估药物对特定基因甲基化的调控效果，为表观遗传药物的研发提供实验支持。

三、实验流程与周期

完整实验流程：样本接收→基因组 DNA 提取与质量检测→甲基化检测方法选择（根据需求选择 Bisulfite 测序、MSP、BSP、焦磷酸测序等）→亚硫酸氢盐处理（将未甲基化的 C 转化为尿嘧啶 U，甲基化 C 保持不变）→目标区域扩增（针对特定基因设计引物）→测序或荧光定量检测→甲基化水平分析（计算甲基化率）。

实验周期：

甲基化特异性 PCR（MSP）/BSP 测序（单个基因）：7-10 个工作日

焦磷酸测序（精确定量甲基化率）：10-12 个工作日

多个基因 Panel 检测（≤10 个基因）：12-15 个工作日

四、客户需提供的样本信息

样本类型：

组织样本：新鲜 / 冷冻组织（≥50mg）、石蜡包埋组织（FFPE，≥5 片，厚度 5-10μm）

细胞样本：贴壁细胞（≥1×10^6 个）、悬浮细胞（≥2×10^6 个）

体液样本：血液（EDTA 抗凝，≥2mL）、血清 / 血浆（≥1mL）、脑脊液（≥500μL）

基因组 DNA：已提取的 DNA（浓度≥50ng/μL，体积≥20μL，OD260/280=1.8-2.0）

样本要求细则：

组织 / 细胞样本：需 - 80℃冷冻保存，避免反复冻融；FFPE 样本需注明固定时间（≤48 小时，甲醛固定最佳），避免酸 / 碱过度处理导致 DNA 降解。

体液样本：血液样本需无溶血（溶血会影响 DNA 质量），运输时 4℃冷藏（≤24 小时）或 - 20℃冷冻。

其他：需提供目标基因名称、物种来源、具体检测区域（如启动子区、CpG 岛位置），若有指定 CpG 位点需提供坐标信息。

五、交付内容及增值服务

1. 基础交付：

完整实验报告（含样本处理流程、检测方法、引物序列、实验参数）

原始数据：PCR 扩增曲线、测序峰图（BSP / 焦磷酸测序）、甲基化率原始计算结果

甲基化分析报告：目标区域甲基化位点分布图、各 CpG 位点甲基化率统计（百分比）、样本间甲基化水平对比表

剩余 DNA 样本：若客户需要，可 - 20℃保存 1 个月

2. 增值分析：

相关性分析：结合客户提供的基因表达数据（如 RT-qPCR 结果），分析甲基化水平与基因表达的关联性（计算相关系数）。

可视化图表：绘制甲基化热图、箱线图（展示不同样本组的甲基化差异），符合学术论文发表格式。

位点筛选建议：针对多 CpG 位点区域，筛选出与表型关联最显著的关键位点，辅助后续机制研究。

六、技术优势

多方法学覆盖：提供从定性（MSP）到定量（焦磷酸测序、BSP）的全流程检测，可根据样本量、精度需求选择最优方案（如低样本量选焦磷酸测序，高通量筛选选 MSP）。

亚硫酸氢盐转化效率高：采用商业化亚硫酸氢盐转化试剂盒（如 Qiagen EZ DNA Methylation Kit），搭配优化的孵育程序，确保未甲基化 C 转化效率≥99%，甲基化 C 保留率≥98%。

引物设计专化性强：针对亚硫酸氢盐处理后的 DNA 序列（高 AT 含量）设计特异性引物，避免非特异性扩增；通过预实验验证引物效率，确保扩增专一性。

质控严格：每批次实验设置阳性对照（已知高甲基化样本）、阴性对照（已知低甲基化样本）及无模板对照，保证结果可靠性；焦磷酸测序采用三次技术重复，确保甲基化率 CV 值＜5%。

七、常见问题（FAQ）

Q：不同检测方法的适用场景有何区别？

A：MSP 适合快速定性（判断甲基化 “有 / 无”），成本较低；BSP 测序可检测多个 CpG 位点，适合区域甲基化模式分析；焦磷酸测序定量精度最高（±1%），适合精确比较样本间甲基化差异（如临床样本分型）。

Q：FFPE 样本 DNA 降解严重，能做甲基化检测吗？

A：FFPE 样本 DNA 片段化后仍可检测（需扩增短片段，≤200bp）。我方会设计覆盖目标区域的短片段引物，结合高保真酶扩增，确保检测成功率＞80%。

Q：甲基化率如何计算？

A：对于 BSP 测序，计算甲基化位点占总检测位点的比例；对于焦磷酸测序，直接读取每个 CpG 位点的甲基化 C 与未甲基化 T 的峰高比值，结果以百分比表示（0%-100%）。