一、技术概述

原位杂交（ISH）及荧光原位杂交（FISH）是通过标记的核酸探针与组织或细胞内靶核酸（DNA/RNA）特异性结合，实现靶序列在原位（细胞或组织内）的定位与检测的技术。ISH 以放射性或显色标记探针为主，通过显色反应观察信号；FISH 采用荧光标记探针，结合荧光显微镜成像，具有更高的灵敏度和分辨率。两者均能保留样本的形态学特征，直观展示靶核酸的空间分布，是研究基因表达定位、染色体结构异常的重要工具。

二、核心应用场景

基因表达定位：检测 mRNA 在组织切片或细胞中的表达位置（如肿瘤组织中癌基因的原位表达分布），用于解析基因功能的空间特异性。

病原体检测：在感染组织中定位病毒（如 HPV、EBV）或细菌核酸，明确病原体感染的细胞类型及扩散范围。

染色体异常分析（FISH）：检测染色体数目异常（如三体综合征）、结构异常（如易位、缺失），用于细胞遗传学诊断或肿瘤分型（如乳腺癌 HER2 基因扩增检测）。

胚胎发育研究：追踪胚胎发育过程中关键基因的时空表达模式，解析细胞分化的分子机制。

联合表型分析：与免疫组化技术结合，同时检测靶 RNA 和蛋白表达，关联基因转录与翻译水平的表达关系。

三、实验流程与周期

完整实验流程：样本接收→样本预处理（组织切片 / 细胞爬片制备、固定）→预处理（脱蜡、蛋白酶消化，增强探针穿透性）→探针杂交（标记探针与靶核酸退火结合）→洗去未结合探针（降低背景信号）→信号检测（ISH 显色 / FISH 荧光信号放大）→复染（DAPI 染核，确定细胞位置）→成像与分析。

实验周期：

RNA 原位杂交（ISH）：7-10 个工作日

荧光原位杂交（FISH，针对特定基因）：10-12 个工作日

多探针联合检测（≤3 个靶标）：12-15 个工作日

四、客户需提供的样本信息

样本类型：

组织样本：新鲜冷冻组织（需 OCT 包埋，-80℃保存）、石蜡包埋组织（FFPE，≥5 片，厚度 4-6μm）

细胞样本：细胞爬片（贴壁细胞，长满率 70%-80%）、细胞涂片（悬浮细胞，密度适中）

其他：染色体标本（用于染色体异常检测）

样本要求细则：

冷冻组织：取材后 30 分钟内 OCT 包埋并 - 80℃冻存，避免冰晶形成（可采用梯度降温）；切片需贴附于防脱载玻片，-20℃保存。

FFPE 样本：固定需用 10% 中性福尔马林（pH 7.0-7.4），固定时间 6-24 小时（过短易脱片，过长影响核酸完整性）；脱蜡需彻底（使用新鲜二甲苯）。

细胞样本：爬片需用多聚赖氨酸包被载玻片，细胞培养至对数期后用 4% 多聚甲醛固定 15 分钟，PBS 洗涤后干燥保存。

其他：需提供靶核酸信息（基因名称、物种、NCBI 登录号）、检测类型（RNA/DNA），若为 FISH 需注明是否检测染色体异常（如特定融合基因、拷贝数变异）。

五、交付内容及增值服务

1. 基础交付：

完整实验报告（含样本处理步骤、探针序列及标记方式、杂交条件、成像参数）

原始图像：ISH 显色切片照片（明场显微镜）、FISH 荧光图像（含 DAPI 核染与靶信号叠加图），每张样本提供 3-5 个视野（含高倍镜视野）

信号分析结果：靶信号阳性细胞比例统计、信号强度分级（弱 / 中 / 强）、信号分布描述（如胞质 / 胞核定位）

2. 增值分析：

定量分析：通过 Image-Pro Plus 软件对 FISH 信号进行定量（如计算平均每细胞信号点数，用于基因拷贝数分析）。

共定位分析：若为多探针检测，提供信号共定位系数计算，展示不同靶标的空间关联。

数字化切片：将染色切片扫描为全视野数字切片，可通过软件缩放观察细节，方便长期保存与数据分析。

六、技术优势

探针设计优化：针对靶核酸序列（RNA/DNA）设计高特异性探针（长度 50-100nt），避免交叉杂交；FISH 采用荧光标记的锁核酸（LNA）探针，增强与靶序列的结合力，提升信号强度。

信号放大技术：ISH 采用生物素 - 链霉亲和素 - 辣根过氧化物酶系统放大信号，FISH 结合酪胺信号放大（TSA）技术，可检测低丰度靶核酸（如低表达 mRNA）。

背景控制严格：通过优化蛋白酶消化时间（避免过度消化导致样本脱落）、杂交温度及洗涤强度，降低非特异性结合；阴性对照（采用无关探针或 sense 探针）确保信号特异性。

成像设备先进：配备 Leica DM6 B 正置荧光显微镜及 Hamamatsu 相机，支持多通道荧光成像与自动拼接，确保图像清晰度与色彩还原度。

七、常见问题（FAQ）

Q：ISH 和 FISH 如何选择？

A：若需观察靶核酸的组织学定位且对分辨率要求不高，可选择 ISH（成本较低）；若需检测低丰度靶标、多靶标共定位或染色体细微结构异常，优先选择 FISH（灵敏度高、信号更清晰）。

Q：FFPE 样本做 RNA 原位杂交成功率高吗？

A：FFPE 样本 RNA 易降解，需选择短片段探针（≤100nt）并优化预处理步骤（如延长蛋白酶消化时间）。我方针对 FFPE 样本的 RNA ISH 成功率可达 85% 以上，尤其适合检测中高丰度 mRNA。

Q：信号背景过高是什么原因？

A：可能因探针浓度过高、洗涤不充分或样本自身杂质多导致。我方会通过调整探针稀释比例、增加洗涤次数或优化封闭步骤降低背景，若问题持续，将免费重新实验。