一、实验简介

Western Blot（蛋白免疫印迹）是分子生物学领域用于蛋白质定性检测、半定量分析及分子量鉴定的经典技术。其核心原理是通过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将蛋白质样本按分子量大小分离，再经转膜将凝胶上的蛋白转移至固相膜（如 PVDF 膜、硝酸纤维素膜），随后利用特异性抗体与靶蛋白结合，最终通过化学发光或荧光检测实现靶蛋白的可视化与分析。

该技术是验证蛋白表达与否、比较不同样本中靶蛋白相对含量的关键手段，广泛应用于基础科研、药物研发及临床前研究等领域。

二、核心应用场景

蛋白表达验证：检测特定基因在翻译水平的表达情况（如转染细胞中重组蛋白的表达验证、基因敲除 / 敲降后靶蛋白的表达变化）。

蛋白修饰分析：检测蛋白的磷酸化、乙酰化等翻译后修饰（如信号通路中激酶磷酸化水平的变化）。

蛋白分子量鉴定：通过与标准蛋白分子量 Marker 对比，确定靶蛋白的实际分子量，辅助蛋白结构研究。

临床样本分析：在疾病机制研究中，比较正常组织与病变组织（如肿瘤组织）中靶蛋白的表达差异，筛选潜在蛋白标志物。

三、实验流程与周期

完整实验流程：

样本接收→蛋白提取（含蛋白酶抑制剂 / 磷酸酶抑制剂，防止蛋白降解或去修饰）→蛋白定量（BCA 法 / Bradford 法）→SDS-PAGE 凝胶制备与电泳→转膜（湿转 / 半干转）→膜封闭（封闭非特异性结合位点）→一抗孵育（特异性结合靶蛋白）→二抗孵育（结合一抗，携带检测标记）→化学发光 / 荧光检测→结果分析与成像。

实验周期：

标准流程为7-10 个工作日（若需同时检测多个靶蛋白或优化实验条件，周期可根据样本数量与检测需求适当调整，最长不超过 12 个工作日）。

四、客户需提供的样本信息

1. 样本类型

细胞样本：贴壁细胞（≥1×10^6 个）、悬浮细胞（≥2×10^6 个）

组织样本：新鲜动物组织（≥100mg）、植物组织（≥200mg）、冷冻保存组织（-80℃保存，避免反复冻融）

蛋白样本：已提取的总蛋白（浓度≥1μg/μL，体积≥20μL，需提供蛋白定量报告）

2. 样本要求细则

细胞样本：需注明细胞系名称、培养状态（对数生长期为佳），收集后用 PBS 清洗 2-3 次，去除培养基残留，离心后吸干上清，-80℃冷冻保存。

组织样本：需去除脂肪、结缔组织等非目标组织，切成小块（≤1mm³）后立即冷冻；若为石蜡包埋组织，需提供≥5 片（厚度 5-8μm），并注明是否需进行脱蜡处理。

蛋白样本：需添加蛋白酶抑制剂（如 PMSF）和磷酸酶抑制剂（如需检测磷酸化蛋白），避免蛋白降解；若样本中含有高浓度盐、去污剂或还原剂，需提前告知，以便优化上样条件。

其他：需提供靶蛋白名称、物种来源（如人 / 小鼠 / 大鼠）、预期分子量，若客户提供一抗，需注明抗体克隆号、来源（兔抗 / 鼠抗）及最佳稀释比例（无则由我方优化）。

五、交付内容及增值服务

1. 基础交付：

完整实验报告（含试剂品牌、仪器型号、关键步骤参数、抗体信息）

原始检测图像（化学发光曝光图 / 荧光扫描图，含分子量 Marker 标注）

蛋白定量原始数据（BCA/Bradford 法标准曲线及样本浓度计算结果）

剩余样本（若客户需要，蛋白样本可 80℃保存 1 个月，组织样本可保存 2 个月）

2. 增值分析：

半定量分析：通过 ImageJ 软件对靶蛋白条带灰度值进行定量，计算不同样本中靶蛋白的相对表达量（以内参蛋白如 GAPDH、β-actin 校正）。

结果解读：针对条带清晰度、非特异性条带、信号强度等问题提供专业分析（如条带模糊可能的原因：转膜不完全、抗体特异性不足），并给出后续优化建议（如调整上样量、更换抗体克隆号）。

格式优化：可根据客户需求，将检测结果整理为学术论文标准格式的图片（含标注、比例尺、重复实验结果合并）。

六、技术优势

实验严谨性：全程添加内参蛋白校正，每批次实验设置阳性对照（已知高表达靶蛋白的样本）和阴性对照（空白载体转染细胞 / 正常组织），确保结果可靠性。

技术灵活性：可根据靶蛋白分子量（10-200kDa）定制 SDS-PAGE 凝胶浓度（8%-15%），针对疏水蛋白、大分子量蛋白等特殊蛋白提供专属转膜方案（如延长转膜时间、调整转膜电压）。

设备与试剂保障：采用 Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳系统、Trans-Blot 半干转印系统，搭配 Millipore PVDF 膜及 Thermo Scientific 化学发光底物，保证条带分辨率高、信号强、背景低。

七、常见问题（FAQ）

Q：检测磷酸化蛋白需要特别注意什么？

A：需在蛋白提取时添加专用磷酸酶抑制剂（如 Na3VO4、NaF），防止磷酸基团脱落；转膜后需用封闭液（如 5% 脱脂牛奶或 BSA）封闭，避免非特异性结合，且一抗需选择磷酸化位点特异性抗体。

Q：若实验结果未检测到靶蛋白条带，会重新实验吗？

A：我方会先排查原因（如样本中靶蛋白表达量过低、抗体失效、实验步骤误差），若为我方操作失误导致，将免费重新实验；若为样本本身问题（如靶蛋白不表达），会提供详细排查报告，并协助客户调整实验方案（如增加上样量、更换检测抗体）。

Q：可以同时检测同一样本中的多个靶蛋白吗？

A：可以。若靶蛋白分子量差异较大（≥20kDa），可通过同一凝胶电泳、转膜后分区域孵育不同一抗；若分子量接近，可采用 stripping 技术（剥离膜上已结合的抗体）后重新孵育其他一抗，具体方案可根据靶蛋白信息定制。