实验介绍
一、实验简介
PCR（聚合酶链式反应）及其衍生技术（qPCR、RT-qPCR）是分子生物学中用于核酸（DNA/RNA）体外扩增与检测的核心技术。三者均基于DNA双链复制原理，通过引物特异性结合靶序列，利用 DNA 聚合酶实现目的片段的指数级扩增，最终实现对靶核酸的定性或定量分析。作为基因研究的基础工具，这些技术广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定等场景，是从 “核酸样本” 到 “基因信息” 的关键转化手段。
1.普通 PCR（定性PCR）
核心功能：通过扩增特定 DNA 片段，实现靶序列的定性检测（如 “是否存在某基因”“片段大小验证”）。
技术特点：无荧光检测模块，需通过琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物的有无及大小，适合快速验证或初步筛选。
2. qPCR（实时荧光定量 PCR）
核心功能：在 PCR 扩增过程中，通过荧光信号实时监测产物量，实现对初始 DNA 模板的定量分析（绝对定量 / 相对定量）。
技术特点：无需电泳，直接输出定量结果；通过溶解曲线分析可验证扩增特异性，结果更精准。
3. RT-qPCR（反转录 实时荧光定量 PCR）
核心功能：以 RNA 为初始模板，先经反转录合成 cDNA，再通过 qPCR 定量，最终反映基因的转录表达水平（mRNA 丰度）。
技术特点：整合反转录与 qPCR 步骤，是研究基因表达差异的 “金标准”，可区分基因在不同组织 / 处理下的活性变化。
二、核心应用场景
技术类型 | 典型应用 |
普通 PCR | ・质粒 / 载体构建后的插入片段验证 ・基因分型（如 SNP 检测初步筛选） ・病原体定性检测（如病毒 / 细菌是否感染） |
qPCR | ・病原体载量定量（如病毒拷贝数计算） ・基因拷贝数变异（CNV）分析 ・转基因生物的目的基因拷贝数检测 |
RT-qPCR | ・不同组织 / 细胞中基因表达量差异分析（如肿瘤 vs 正常组织） ・药物处理后基因上调 / 下调验证 ・非编码 RNA（miRNA、lncRNA）表达分析 |
三、实验流程与周期
共性流程：样本接收→核酸提取（DNA/RNA）→引物设计与验证→扩增体系优化→实验检测→结果分析
分述周期：
普通 PCR：5-7 个工作日（含电泳验证）
qPCR：7-10 个工作日（含标准曲线制备、复孔重复）
RT-qPCR：8-12 个工作日（含 RNA 质量检测、反转录步骤）
四、客户需提供的样本信息
1. 样本类型
组织样本：新鲜 / 冷冻组织（动物、植物、微生物）、石蜡包埋组织（FFPE）
体液样本：血液（EDTA / 肝素抗凝）、血清、血浆、脑脊液、尿液等
核酸样本：已提取的 DNA（浓度≥5ng/μL）或 RNA（浓度≥10ng/μL，RIN 值≥7.0）
2. 样本要求细则
组织样本：重量≥50mg（动物）/100mg（植物），-80℃冷冻保存，避免反复冻融；FFPE 样本需提供≥5 片（厚度 5-10μm），附带病理诊断信息。
体液样本：血液≥2mL，血清 / 血浆≥500μL，需 4℃冷藏运输（超过 24 小时需干冰）。
核酸样本：需提供浓度、纯度检测报告（如 Nanodrop 数据），RNA 样本需注明是否去除基因组 DNA。
其他：需提供靶基因名称、物种信息（如人 / 小鼠 / 大鼠），若有指定引物需提供序列及验证报告。
五、交付内容及增值服务
1. 基础交付：
实验报告（含详细流程、试剂品牌、仪器型号）
原始数据（如电泳图片、qPCR 原始 Ct 值、溶解曲线）
样本剩余物（若客户需要，可冷藏保存 1 个月）
2. 增值分析：
qPCR 定量结果：绝对定量（拷贝数 /μL）或相对定量（2^-ΔΔCt 法计算的表达倍数），附统计学分析（标准差、P 值）。
可视化图表：扩增曲线、溶解曲线图、表达差异柱状图 / 折线图（可按需调整图表格式）。
结果解读：针对异常结果（如扩增效率低、非特异性峰）提供可能原因分析及后续建议。
六、技术优势
仪器保障：采用 ABI QuantStudio 6 Flex 实时荧光定量 PCR 仪，检测灵敏度达 10 copies/μL，线性范围覆盖 7 个数量级。
质控体系：每批次实验设置阴性对照（无模板）、阳性对照（已知浓度标准品）、3 次技术重复，确保 CV 值＜5%。