实验介绍
一、实验简介
蛋白质组（Proteomics）是通过高通量检测技术对细胞、组织或体液中的全部蛋白质进行系统鉴定、定量及功能分析的核心组学技术。其核心原理是利用蛋白质的物理化学特性（如分子量、电荷、疏水性），通过质谱技术（如 LC-MS/MS）对蛋白质酶解后的肽段进行检测，结合数据库搜索（如 UniProt）实现蛋白质鉴定，再通过标签标记（如 TMT、iTRAQ）或无标记定量技术（LFQ）量化蛋白质表达水平，最终揭示蛋白质在不同生理、病理状态下的表达差异、翻译后修饰及相互作用网络。该技术弥补了转录组与蛋白质组的表达差异（如 mRNA 与蛋白质表达的不一致性），可直接反映生物功能的执行分子状态，是疾病标志物筛选、药物作用靶点验证、信号通路机制解析的关键工具，广泛应用于基础医学、转化医学及药物研发领域。
二、核心应用场景
蛋白质表达差异分析：
疾病机制研究：在肿瘤（如肺癌、乳腺癌）、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）、代谢疾病（如糖尿病）等模型中，对比疾病组与正常组的蛋白质表达谱，筛选疾病特异性差异表达蛋白（如肿瘤中高表达的增殖相关蛋白 Ki-67、代谢疾病中异常的胰岛素信号通路蛋白），构建疾病相关蛋白质表达网络，揭示疾病发生发展的分子机制。
药物疗效评估：检测药物干预前后（如化疗药物、靶向药物）细胞或组织中的蛋白质表达变化，鉴定药物调控的关键蛋白（如抗炎药物抑制的炎症因子 TNF-α、IL-6，抗肿瘤药物下调的癌蛋白 MYC），评估药物对疾病相关蛋白的调控效果，验证药物作用的有效性。
组织 / 细胞特异性蛋白质分析：对比同一物种不同组织（如肝脏、大脑、心脏）或不同细胞类型（如干细胞、免疫细胞、肿瘤细胞）的蛋白质组，筛选组织 / 细胞特异性标志物（如肝细胞中的白蛋白 ALB、神经细胞中的突触蛋白 SYN1），为细胞分型、组织损伤诊断提供分子依据。
蛋白质翻译后修饰（PTM）分析：
磷酸化修饰：通过富集磷酸化肽段（如 TiO₂、IMAC 富集法），鉴定蛋白质的磷酸化位点（如丝氨酸 Ser、苏氨酸 Thr、酪氨酸 Tyr 磷酸化），分析信号通路的激活状态（如 MAPK 通路中 ERK 蛋白的磷酸化水平升高提示通路激活），揭示蛋白质磷酸化在细胞增殖、凋亡、分化中的调控作用（如肿瘤细胞中异常的 AKT 磷酸化导致细胞恶性增殖）。
乙酰化修饰：富集乙酰化肽段（如免疫沉淀法），检测组蛋白、代谢酶等蛋白质的乙酰化修饰（如组蛋白 H3K9 乙酰化促进基因转录，代谢酶乙酰化调控糖脂代谢），研究乙酰化修饰在基因表达调控、代谢紊乱疾病中的作用（如脂肪肝中乙酰辅酶 A 羧化酶的乙酰化异常影响脂肪合成）。
糖基化修饰：分析蛋白质的 N - 糖基化、O - 糖基化修饰（如凝集素亲和层析富集糖肽），鉴定糖基化位点与糖链结构，研究糖基化在蛋白质折叠、细胞黏附、免疫识别中的功能（如肿瘤细胞表面糖蛋白的异常糖基化导致免疫逃逸）。
蛋白质相互作用与功能网络分析：
蛋白质相互作用鉴定：通过免疫共沉淀（Co-IP）联合质谱技术，筛选目标蛋白的相互作用蛋白（如鉴定 p53 蛋白的结合蛋白 MDM2，揭示 p53 的泛素化降解调控机制），构建蛋白质相互作用网络（PPI 网络），解析蛋白质复合物的组成与功能（如核糖体、蛋白酶体等复合物的蛋白质组成分析）。
功能通路富集与网络构建：将差异表达蛋白或修饰蛋白映射到 GO（基因本体论）、KEGG（京都基因与基因组百科全书）、Reactome 等数据库，富集显著变化的生物学过程（如细胞凋亡、氧化应激、物质代谢）与信号通路（如 PI3K-AKT 通路、NF-κB 通路），通过 Cytoscape 等工具构建蛋白质功能调控网络，筛选网络中的核心枢纽蛋白（如 PPI 网络中连接度高的蛋白，可能为疾病治疗的关键靶点）。
三、实验流程与周期
完整实验流程：
样本接收→样本预处理（细胞 / 组织裂解：使用 RIPA 裂解液提取总蛋白，添加蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂防止蛋白降解与修饰丢失；体液样本如血清 / 血浆需去除高丰度蛋白如白蛋白、IgG，避免干扰）→蛋白质定量（BCA 法、Bradford 法检测蛋白浓度，确保样本蛋白量充足）→蛋白质酶解（用胰蛋白酶将蛋白质酶解为肽段，酶解效率≥90%）→肽段分离与富集（如需修饰分析，进行磷酸化 / 乙酰化 / 糖基化肽段富集；常规表达分析可直接进行液相色谱分离）→LC-MS/MS 检测（使用高分辨率质谱仪如 QE-HF、Orbitrap Fusion，采用数据依赖采集 DDA 或数据非依赖采集 DIA 模式，获取肽段质谱数据）→数据检索与分析（通过 MaxQuant、Proteome Discoverer 等软件比对 UniProt 数据库，鉴定蛋白质；采用 TMT/iTRAQ 标记定量或 LFQ 无标记定量计算蛋白质表达量；修饰分析需额外筛选修饰位点）→差异蛋白筛选（设定阈值：|log2FC|≥1 且 P 值＜0.05 或 FDR＜0.05）→功能富集与网络分析→报告撰写。
实验周期：
常规蛋白质组表达分析（≤20 个样本，TMT/iTRAQ 标记或 LFQ 无标记）：14-18 个工作日（含样本预处理、酶解、质谱检测、基础数据分析）。
蛋白质翻译后修饰分析（如磷酸化、乙酰化，≤15 个样本）：18-22 个工作日（含修饰肽段富集、质谱检测、修饰位点鉴定与定量分析）。
蛋白质相互作用分析（Co-IP + 质谱，≤10 个样本）：16-20 个工作日（含 Co-IP 实验、蛋白富集、质谱检测、相互作用蛋白鉴定）。
个性化分析（如大样本量、多修饰联合分析）：根据样本数量与分析需求，额外增加 5-10 个工作日。
四、客户需提供的样本信息
样本类型：
细胞样本：贴壁细胞（≥1×10^7 个）、悬浮细胞（≥2×10^7 个），处于对数生长期，活力≥90%，收集后用 PBS 清洗 2-3 次，去除培养基残留，避免血清蛋白干扰。
组织样本：新鲜组织（≥200mg）、冷冻组织（≥200mg，-80℃冻存，避免反复冻融）、FFPE 组织（≥10 片，厚度 5-10μm，固定时间 6-24h，10% 中性福尔马林固定），组织需剔除脂肪、结缔组织等非目标成分（如肿瘤组织需去除坏死区）。
体液样本：血清（≥200μL，空腹采血，3000rpm 离心 10min 分离，避免溶血）、血浆（≥200μL，使用 EDTA 或肝素抗凝管，离心分离）、脑脊液（≥100μL）、尿液（≥500μL，离心去除沉淀），体液样本需注明是否需去除高丰度蛋白。
蛋白样本：已提取的总蛋白（浓度≥1μg/μL，体积≥100μL，纯度 OD280/260=1.5-2.0，无盐离子、去污剂严重污染），需提供蛋白提取方法与抑制剂使用情况（如是否添加蛋白酶抑制剂）。
样本要求细则：
样本保存与运输：细胞 / 组织样本 - 80℃冻存，干冰运输（运输时间≤48h）；蛋白样本 - 20℃冻存，避免反复冻融（≤2 次），运输时用冰袋或干冰；体液样本需添加防腐剂（如叠氮钠，终浓度 0.02%），4℃短期运输（≤24h）或 - 80℃长期冻存后干冰运输。
实验设计信息：明确样本分组（如对照组、疾病组、药物处理组，每组≥3 个生物学重复）、研究目的（如差异表达分析、修饰分析、相互作用鉴定）、定量方式选择（如 TMT/iTRAQ 标记定量、LFQ 无标记定量，标记定量需确定标记通道数如 TMT10plex、iTRAQ8plex）。
特殊要求：若需特定修饰分析（如磷酸化、乙酰化），需注明修饰类型；若有目标蛋白（如研究 p53 相关蛋白），需提供蛋白名称、物种来源及相关背景；若需联合转录组数据进行关联分析，需提前提供转录组差异基因列表。
五、交付内容及增值服务
1. 基础交付：
完整实验报告：含样本处理步骤（裂解液配方、酶解条件、富集方法）、蛋白定量数据（BCA/Bradford 检测结果）、质谱检测参数（仪器型号、采集模式、分辨率、扫描范围）、数据质控报告（肽段匹配率≥80%、蛋白质鉴定数量、定量重复性 CV 值＜15%）、原始数据（RAW 格式质谱文件，上传至安全云平台）。
核心分析结果：
蛋白质鉴定与定量：鉴定蛋白质列表（含蛋白 ID、分子量、等电点、覆盖度）、蛋白质表达量矩阵（TMT/iTRAQ 标记定量的报告离子强度、LFQ 无标记定量的肽段强度）、样本间蛋白质表达相关性热图、主成分分析（PCA）图（评估样本分组有效性）。
差异蛋白质分析：差异蛋白质列表（含 | log2FC|、P 值 / FDR 值、表达变化趋势）、差异蛋白火山图、聚类热图（Top 50/100 差异蛋白）、差异蛋白表达倍数统计柱状图。
功能富集分析：GO 富集分析结果（生物过程 BP、分子功能 MF、细胞组分 CC，含富集显著性 P 值、富集蛋白数量，以气泡图、柱状图展示）、KEGG 通路富集图（标注通路中差异蛋白的表达变化）、Reactome 通路富集列表。
实验材料留存：剩余蛋白样本（-80℃保存 1 个月）、酶解后的肽段样本（-20℃保存 1 个月，如需后续验证可提供）。
2.增值服务：
高级蛋白质组分析：蛋白质翻译后修饰位点鉴定（如磷酸化位点列表，含修饰氨基酸、置信度）、修饰位点定量分析（不同组间修饰水平差异）、蛋白质相互作用网络（PPI 网络）构建（用 Cytoscape 软件绘制，标注核心枢纽蛋白）。
多组学联合分析：若客户提供转录组（RNA-seq）、代谢组数据，可进行蛋白质组 - 转录组关联分析（如 mRNA 与蛋白质表达相关性分析，筛选转录后调控的蛋白）、蛋白质组 - 代谢组关联分析（如酶蛋白与代谢产物浓度相关性，揭示代谢通路调控机制），生成多组学整合报告与可视化图表。
验证实验支持：根据差异蛋白结果，设计 Western Blot 验证方案（提供抗体推荐列表、稀释比例、实验步骤），协助进行 Co-IP 实验验证蛋白质相互作用，提供修饰蛋白的靶向验证方法（如磷酸化抗体的 Western Blot 检测）。
个性化数据挖掘：针对特定研究方向（如肿瘤转移、神经退行性病变），进行疾病相关通路的深度解析（如筛选 PI3K-AKT 通路中关键差异蛋白的上下游调控关系）、潜在生物标志物筛选（如 ROC 曲线分析评估差异蛋白的诊断效能）、药物靶点优先级排序（结合蛋白表达差异、功能重要性、成药性评分）。
六、技术优势
检测灵敏度与覆盖度高：采用高分辨率质谱仪（如 Orbitrap Fusion，分辨率可达 120,000 FWHM），结合高效液相色谱（如纳升液相色谱 nano-LC）分离技术，可鉴定到低丰度蛋白质（如信号通路蛋白、转录因子，浓度低至 ng/mL 级别），常规样本单次实验可鉴定 3000-5000 种蛋白质，深度覆盖样本蛋白质组（如细胞样本蛋白质鉴定率≥80%）。
定量准确性与重复性好：TMT/iTRAQ 标记定量技术采用同位素标记肽段，可实现多样本同时定量（如 TMT18plex 可同时分析 18 个样本），定量 CV 值＜15%；LFQ 无标记定量技术通过肽段强度归一化，避免标记试剂偏差，定量准确性与标记定量相当，两种定量方式均通过质控样本（如标准蛋白混合物）验证，确保组间差异定量可靠。
样本适应性强：针对不同类型样本（细胞、组织、体液、FFPE 样本）优化预处理方案 —— 如 FFPE 样本采用抗原修复液辅助蛋白提取，去除甲醛交联影响；血清样本通过高丰度蛋白去除柱（如 Multiple Affinity Removal System）降低白蛋白、IgG 干扰；低丰度样本（如外泌体、微量组织）采用肽段富集与质谱信号放大技术，确保蛋白质鉴定与定量效果。
数据分析专业全面：拥有专业生物信息学团队，使用 MaxQuant、Proteome Discoverer、Perseus 等主流分析软件，结合自建的物种特异性数据库（如人、小鼠、大鼠的 UniProt 数据库子集，包含最新注释信息），避免数据库冗余导致的鉴定误差；提供多维度功能富集分析与可视化图表，确保分析结果符合学术论文发表标准（如 Nature、Cell 系列期刊的数据分析要求）。
七、常见问题（FAQ）
Q：蛋白质组定量结果与转录组（RNA-seq）结果的相关性较低，是什么原因导致的？如何解读这种差异？
A：相关性较低的主要原因包括：① 转录后调控：mRNA 的转录与蛋白质翻译存在时间差，且受 miRNA 抑制翻译、蛋白质降解（如泛素 - 蛋白酶体系统）等调控，导致 mRNA 与蛋白质表达不同步（如某些转录因子 mRNA 高表达，但蛋白质因降解快而低表达）；② 检测技术差异：RNA-seq 检测的是 mRNA 水平，蛋白质组检测的是功能执行分子，且两者的检测灵敏度、动态范围不同（如低丰度 mRNA 可能未被检测，但对应的蛋白质因稳定性高被检出）；③ 样本异质性：若转录组与蛋白质组样本来自不同批次或处理条件（如样本保存时间、处理方法不同），也会导致相关性降低。解读时需关注：① 筛选 mRNA 与蛋白质表达趋势一致的差异分子，这些分子可能受转录水平调控，是疾病 / 药物干预的核心靶点；② 重点分析表达趋势不一致的分子，挖掘转录后调控机制（如 miRNA 对蛋白质翻译的抑制作用）；③ 结合功能通路，若通路中 mRNA 与蛋白质整体趋势一致，说明通路调控主要发生在转录水平，反之则存在转录后调控。
Q：血清、血浆等体液样本中高丰度蛋白（如白蛋白、IgG）会对蛋白质组分析产生什么影响？如何有效去除？
A：高丰度蛋白的影响：① 占据质谱检测信号：血清中白蛋白占总蛋白的 50% 以上，IgG 占 10%-20%，其酶解后的肽段会大量占用质谱扫描时间，导致低丰度蛋白（如细胞因子、肿瘤标志物）的肽段无法被检测；② 干扰低丰度蛋白鉴定：高丰度蛋白的肽段可能与低丰度蛋白的肽段在色谱上共洗脱，或在数据库检索中掩盖低丰度蛋白的匹配信号，导致低丰度蛋白鉴定率降低。去除方法：① 亲和层析法：使用针对高丰度蛋白的特异性抗体柱（如白蛋白抗体柱、IgG 抗体柱）或凝集素柱，通过免疫亲和作用吸附并去除高丰度蛋白；② 化学沉淀法：利用高丰度蛋白在特定条件下的溶解度差异（如 pH 值、盐浓度变化），通过沉淀（如硫酸铵沉淀、丙酮沉淀）去除部分高丰度蛋白；③ 分子筛层析法：通过凝胶过滤色谱（如 Superdex 200）分离不同分子量的蛋白质，收集低分子量组分（含低丰度蛋白），去除高分子量的高丰度蛋白（如白蛋白分子量 66kDa，IgG 分子量 150kDa）。我方通常采用亲和层析法（如 Agilent Multiple Affinity Removal System），可去除血清中 95% 以上的白蛋白与 IgG，显著提升低丰度蛋白的鉴定数量（如去除前鉴定 200-300 种蛋白，去除后可鉴定 1000-1500 种蛋白）。
Q：如何选择蛋白质组的定量方式（TMT/iTRAQ 标记定量 vs LFQ 无标记定量）？两种方式各有什么优缺点？
A：选择需结合样本数量、研究目的、预算成本综合判断，两种方式的优缺点如下：
选择建议：若样本量≤20 个且需多组比较，优先选 TMT/iTRAQ 标记定量；若样本量＞30 个或成本有限，优先选 LFQ 无标记定量；若同时关注低丰度蛋白与定量重复性，可采用 “标记定量初筛 + 无标记定量验证” 的组合方案，兼顾结果可靠性与成本效益。
TMT/iTRAQ 标记定量：
优点：① 多样本同时定量：可一次性分析多个样本（如 TMT10plex 分析 10 个样本、TMT18plex 分析 18 个样本），所有样本在同一次质谱运行中检测，能最大程度减少批次效应（如不同质谱运行间的信号波动、肽段分离差异），适合多组比较实验（如对照组 + 3 个药物剂量组 + 2 个时间点组）；② 定量准确性高：同位素标记的报告离子（如 TMT 的 126-138 Da 报告离子）强度比值稳定，组间差异定量 CV 值通常＜15%，且对低丰度蛋白的定量重复性优于无标记技术；③ 样本利用率高：少量蛋白样本（如 50μg 总蛋白）即可完成标记与检测，适合珍贵样本（如临床微量组织、外泌体蛋白）。
缺点：① 成本较高：标记试剂（如 TMT10plex 试剂盒）价格昂贵，样本数量越多，单样本成本虽会降低，但总体成本仍高于无标记定量；② 标记效率影响结果：若肽段标记效率＜95%，未标记肽段会干扰定量准确性，需在实验前优化标记条件（如反应温度、时间、试剂比例）；③ 无法追溯原始样本信号：报告离子信号是多个样本肽段的混合信号，若某一样本存在异常（如蛋白降解），难以单独剔除，可能影响整体定量结果。
适用场景：多组比较实验（如药物剂量梯度、时间序列分析）、珍贵小样本检测、对定量重复性要求高的研究（如临床样本验证）。
LFQ（Label-Free Quantification）无标记定量：
优点：① 成本低：无需购买昂贵的标记试剂，实验流程更简洁，适合大样本量研究（如 50 个以上临床样本）；② 无标记干扰：直接通过肽段的一级质谱信号强度（如峰面积、峰高）进行定量，避免标记效率、报告离子交叉污染等问题，结果更接近样本真实表达水平；③ 样本灵活性高：可随时添加新样本进行检测（无需与原有样本同步标记），后续可补充实验数据进行整合分析，且能单独剔除异常样本数据，不影响整体结果。
缺点：① 批次效应明显：不同质谱运行间的信号差异较大（如色谱保留时间偏移、离子化效率波动），定量 CV 值通常在 15%-20%，需通过设置质量控制样本（QC 样本）、校正色谱保留时间等方式减少误差；② 对实验重复性要求高：需严格控制样本处理条件（如裂解、酶解时间，上样量），否则会导致肽段检出重复性低，影响定量可靠性；③ 低丰度蛋白定量准确性差：低丰度肽段的信号强度易受高丰度肽段干扰，且在不同质谱运行中检出率不稳定，可能导致低丰度蛋白定量结果缺失或偏差。
适用场景：大样本量研究（如临床队列分析）、初步筛选实验（如差异蛋白初筛）、后续补充实验（如新增样本验证）、对成本敏感的研究项目。