实验介绍
一、实验简介
转录组（RNA-seq）是通过高通量测序技术对细胞或组织中的全部 RNA（mRNA、lncRNA、circRNA 等）进行测序分析，全面解析基因表达水平、转录变体及调控网络的核心组学技术。其核心原理是将 RNA 反转录为 cDNA 后进行深度测序，通过生物信息学分析比对参考基因组，量化每个基因的表达量（FPKM/TPM 值），鉴定差异表达基因（DEG）、可变剪接事件、新转录本及非编码 RNA 的表达特征。该技术具有通量高、分辨率高、无物种依赖的特点，可从整体层面揭示基因表达调控规律，是功能基因组学研究、疾病机制解析、药物靶点筛选的关键工具，广泛应用于基础研究与转化医学领域。
二、核心应用场景
基因表达差异分析：
疾病模型 vs 正常样本对比：在肿瘤、炎症、代谢疾病等模型中，通过 RNA-seq 筛选疾病相关差异表达基因（如肿瘤组织中高表达的癌基因、低表达的抑癌基因），构建疾病特异性表达谱，为疾病诊断标志物筛选提供依据。
药物干预前后对比：检测药物处理后细胞 / 组织的基因表达变化，鉴定药物调控的靶基因及信号通路（如抗炎药物抑制 NF-κB 通路相关基因表达），解析药物作用机制并验证靶点有效性。
不同组织 / 发育阶段对比：分析同一物种不同组织（如肝脏、大脑）或不同发育阶段（如胚胎期、成年期）的基因表达差异，揭示组织特异性基因及发育调控基因（如干细胞分化相关基因）。
转录调控机制研究：
可变剪接分析：鉴定基因的不同转录变体（如 mRNA 的可变剪接异构体），分析疾病或药物干预对剪接模式的影响（如肿瘤细胞中异常剪接导致的功能蛋白变异）。
非编码 RNA 调控：检测 lncRNA、circRNA 等非编码 RNA 的表达水平，结合靶基因预测（如 ceRNA 机制），构建非编码 RNA-mRNA 调控网络（如 lncRNA 通过吸附 miRNA 调控癌基因表达）。
基因融合检测：在肿瘤样本中，通过 RNA-seq 鉴定基因融合事件（如肺癌中 ALK-EML4 融合），为靶向治疗提供潜在靶点。
功能基因组学研究：
基因功能注释：对新物种或未注释基因进行转录组测序，结合同源序列比对与功能富集分析，注释基因的生物学功能（如代谢酶、转录因子）。
通路富集分析：将差异表达基因映射到 KEGG、GO 等数据库，富集显著变化的信号通路（如肿瘤样本中细胞周期通路、凋亡通路异常激活），揭示疾病发生的核心调控通路。
基因共表达网络构建：通过加权基因共表达网络分析（WGCNA），鉴定与疾病表型（如肿瘤转移、血糖水平）高度相关的基因模块，筛选关键调控基因。
三、实验流程与周期
完整实验流程：
样本接收→RNA 提取与质量检测（Nanodrop 检测纯度、Agilent 2100 检测完整性，RIN 值≥7.0）→mRNA 富集（真核生物通过 Oligo (dT) 磁珠筛选 mRNA，原核生物去除 rRNA）→cDNA 文库构建（片段化 RNA、反转录合成 cDNA、加接头、PCR 扩增）→文库质量检测（Qubit 定量、Agilent 2100 检测片段大小，目标片段 200-300bp）→高通量测序（Illumina NovaSeq/HiSeq 平台，PE150/PE250 测序模式）→原始数据过滤（去除低质量 reads、接头序列、rRNA 污染）→序列比对（比对至参考基因组，比对率≥80%）→基因表达定量（计算 FPKM/TPM 值）→差异表达分析（筛选 DEG，|log2FC|≥1 且 FDR＜0.05）→功能富集与调控网络分析→报告撰写。
实验周期：
标准样本（≤30 个）：12-15 个工作日（含 RNA 提取、文库构建、测序及基础数据分析）
复杂样本（如 FFPE 组织、低质量 RNA 样本）：15-20 个工作日（含 RNA 修复与文库优化）
个性化分析（如可变剪接、WGCNA）：额外增加 3-5 个工作日
四、客户需提供的样本信息
样本类型：
细胞样本：贴壁细胞（≥2×10^6 个）、悬浮细胞（≥5×10^6 个），对数生长期，活力≥90%，避免凋亡导致 RNA 降解。
组织样本：新鲜 / 冷冻组织（≥100mg）、FFPE 组织（≥5 片，厚度 5-10μm），新鲜组织需 - 80℃冻存，FFPE 组织需固定充分（10% 中性福尔马林，6-24h）。
RNA 样本：已提取的总 RNA（浓度≥1μg/μL，体积≥50μL，RIN 值≥7.0，OD260/280=1.8-2.0），无基因组 DNA 污染（需提供 DNase 处理证明）。
样本要求细则：
样本保存与运输：细胞 / 组织样本 - 80℃冻存，干冰运输；RNA 样本 - 80℃冻存，避免反复冻融，运输时用干冰或冰袋（24h 内送达）。
物种与参考基因组：提供样本物种（人 / 小鼠 / 大鼠等）、NCBI 物种编号，若为非模式物种需提供参考基因组序列（或委托我方进行 de novo 组装，额外收费）。
实验设计：明确分组信息（如对照组、处理组，每组≥3 个生物学重复）、实验目的（如差异表达分析、通路富集）、是否需要个性化分析（如可变剪接、非编码 RNA 鉴定）。
特殊要求：若样本为低丰度 RNA（如外泌体 RNA），需提前说明（将采用高灵敏度文库构建方案）；若需比较不同批次样本，需提供批次信息（用于批次效应校正）。
五、交付内容及增值服务
1. 基础交付：
完整实验报告：含样本处理步骤、RNA 质量检测报告（Nanodrop/Agilent 数据）、文库构建参数、测序数据质控报告（Q30≥85%、比对率≥80%）、原始数据（FASTQ 格式，上传至 secure 云平台）。
核心分析结果：
基因表达定量：全基因组基因 FPKM/TPM 值矩阵、样本表达量相关性热图、主成分分析（PCA）图（评估样本分组有效性）。
差异表达分析：差异表达基因列表（含 log2FC、FDR 值）、火山图、聚类热图（Top 50/100 DEG）。
功能富集分析：GO（生物过程、分子功能、细胞组分）富集柱状图 / 气泡图、KEGG 通路富集图、显著通路调控关系图。
实验材料留存：剩余 RNA 样本（-80℃保存 1 个月）、未用完的文库（-20℃保存 1 个月）。
2. 增值服务：
高级转录组分析：可变剪接事件鉴定（生成剪接异构体表达矩阵）、基因融合检测（肿瘤样本）、非编码 RNA（lncRNA/circRNA）注释与靶基因预测。
调控网络构建：WGCNA 分析（鉴定关键基因模块）、转录因子 - 靶基因调控网络（结合 JASPAR 数据库预测）、ceRNA 网络分析（lncRNA-miRNA-mRNA 互作）。
验证实验设计：根据差异表达基因结果，设计 qPCR 验证引物（提供引物序列与扩增条件），并协助优化验证实验方案。
多组学联合分析：若客户提供蛋白质组 / 代谢组数据，可进行转录组 - 蛋白质组 / 代谢组关联分析（如表达量相关性、通路协同变化），生成多组学整合报告。
六、技术优势
测序与文库质量保障：采用 Illumina 高保真测序平台，测序错误率＜0.1%，Q30≥85%；针对不同样本类型（新鲜组织、FFPE、低质量 RNA）优化文库构建方案，如 FFPE 样本采用 DNA 修复酶处理，低丰度 RNA 采用线性扩增技术，确保文库质量。
数据分析精准全面：使用 Hisat2/StringTie、DESeq2/edgeR 等主流分析工具，严格控制差异基因筛选标准（|log2FC|≥1 且 FDR＜0.05）；整合 GO、KEGG、Reactome 等多数据库进行功能注释，避免单一数据库的局限性。
个性化方案设计：支持自定义分析需求，如非模式物种 de novo 转录组组装、特定通路（如肿瘤代谢通路）深度解析、时间序列样本的动态表达分析；针对临床样本（如 FFPE）提供合规化数据整理，满足科研与临床申报需求。
质控体系严格：每批次实验设置阳性对照（已知差异表达基因的样本）与阴性对照（空白样本），监控实验流程稳定性；RNA 质量检测、文库质量检测、测序数据质控均设置多重阈值，确保数据可靠性（如 RIN 值＜7.0 的样本拒绝上机测序）。
七、常见问题（FAQ）
Q：RNA-seq 与 RT-qPCR 的结果为何会出现不一致？如何验证 RNA-seq 结果的可靠性？
A：不一致可能因以下原因：① 检测范围不同：RNA-seq 可检测低丰度基因，RT-qPCR 对高丰度基因更敏感；② 数据归一化方式不同：RNA-seq 用 FPKM/TPM 归一化，RT-qPCR 用内参基因校准；③ 可变剪接影响：RNA-seq 检测总转录本，RT-qPCR 可能针对特定剪接异构体。验证方法：① 选择 10-15 个差异基因（高 / 中 / 低丰度）进行 RT-qPCR 验证，相关性 R²≥0.7 提示结果可靠；② 检查样本 PCA 图，确保同一组样本聚类良好（组内差异＜组间差异）；③ 验证阳性对照基因的表达变化（如已知药物靶基因应在处理组中显著差异表达）。
Q：如何选择测序深度？不同样本类型的测序深度需求有何差异？
A：测序深度需根据研究目的与样本类型调整：① 常规差异表达分析：真核生物样本推荐测序深度≥6G clean data / 样本（可检测 95% 以上的表达基因）；② 非编码 RNA 鉴定 / 可变剪接分析：需更高深度（≥10G clean data / 样本），确保低丰度转录本的检出；③ 原核生物样本：测序深度≥3G clean data / 样本（原核基因组小，转录本数量少）；④ FFPE 样本 / 低质量 RNA：建议增加 20%-30% 测序深度，补偿 RNA 降解导致的有效数据损失。
Q：非模式物种无参考基因组，能否进行 RNA-seq 分析？分析流程有何不同？
A：可以。非模式物种需采用 de novo 转录组分析流程，与有参考基因组的差异主要在：① 无序列比对步骤，改为组装 unigene（通过 Trinity 等软件将 clean reads 组装为连续的转录本序列）；② 基因注释通过与 NR、Swiss-Prot、KEGG 等公共数据库进行同源序列比对（BLAST），注释基因功能；③ 差异表达分析基于 unigene 的表达量计算（而非基因组定位）。交付内容增加 unigene 序列库（FASTA 格式）、组装质量评估报告（如 N50 长度、完整度），后续可用于基因克隆、分子标记开发等研究。