一、实验简介

蛋白 / 代谢物定量是通过特异性检测技术，对生物样本（如血清、组织、细胞）中的蛋白质或代谢物进行浓度测定的核心分析技术，可揭示生物体内蛋白质表达水平变化与代谢通路活性，为疾病机制研究、临床诊断与药物研发提供量化依据。

蛋白定量：基于 “抗原 - 抗体特异性结合” 或 “蛋白质理化性质” 实现定量，主流技术包括三类。① ELISA（酶联免疫吸附试验），通过酶促显色反应定量单一蛋白（如细胞因子、肿瘤标志物），检测限达 pg/mL 级；② Western Blot（蛋白质印迹），通过蛋白电泳分离与抗体杂交半定量特定蛋白（如磷酸化蛋白）；③ 质谱技术（如 LC-MS/MS），通过检测蛋白肽段离子信号定量多种蛋白（如蛋白质组学分析），可同时分析数百种蛋白。

代谢物定量：针对生物体内小分子代谢物（如糖、氨基酸、脂质、有机酸），通过两类核心技术定量。① 色谱技术（如 HPLC、UPLC），结合紫外、荧光检测器定量单一或少数代谢物（如血糖、血脂）；② 质谱联用技术（如 GC-MS、LC-MS/MS），通过分离代谢物与检测特征离子，实现高通量、高特异性定量（如检测数十至数百种代谢物的代谢组学分析），检测限达 ng/mL 至 pg/mL 级。

该技术广泛应用于临床诊断（如通过肿瘤标志物定量辅助癌症筛查）、药物研发（如监测药物对代谢通路的影响）与基础科研（如分析疾病状态下蛋白 / 代谢物差异），其定量准确性直接决定下游结论的可靠性，需严格控制实验重复性与检测特异性。

二、核心应用场景

（一）临床疾病诊断与监测

肿瘤诊断与疗效评估：

肿瘤标志物定量：通过 ELISA 或化学发光法检测血清中的肿瘤标志物（如癌胚抗原 CEA、甲胎蛋白 AFP、糖类抗原 CA125），辅助癌症筛查（如 AFP 升高提示肝癌风险）、疗效监测（如化疗后 CEA 浓度下降提示治疗有效）与复发预警（如术后 CA19-9 持续升高提示胰腺癌复发）；

肿瘤相关蛋白定量：通过 LC-MS/MS 检测组织中肿瘤驱动蛋白（如 EGFR、HER2）的表达量，指导靶向药物选择（如 HER2 高表达患者使用抗 HER2 药物）。

代谢性疾病诊断：

常规代谢指标检测：通过 HPLC 或生化分析仪定量血清中的葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、尿酸等，诊断糖尿病、高血脂、高尿酸血症；

罕见代谢病筛查：通过 GC-MS 检测尿液或血液中的有机酸（如丙酸、甲基丙二酸），诊断有机酸代谢紊乱（如丙酸血症）；通过 LC-MS/MS 检测氨基酸（如苯丙氨酸），筛查苯丙酮尿症（PKU）。

自身免疫病与炎症监测：通过 ELISA 定量血清中的炎症因子（如 IL-6、TNF-α、C 反应蛋白 CRP），评估炎症活动度（如类风湿关节炎患者 IL-6 浓度与疾病严重程度正相关）；定量自身抗体（如抗环瓜氨酸肽抗体抗 - CCP），辅助自身免疫病诊断。

（二）药物研发与药理学分析

药代动力学（PK）与药效动力学（PD）研究：

药物浓度定量：通过 LC-MS/MS 检测血浆中的药物及其代谢产物浓度（如小分子药物、抗体药物），绘制血药浓度 - 时间曲线，计算 PK 参数（如 Cmax、AUC、半衰期 t₁/₂），指导临床剂量设计；

药效标志物定量：检测药物作用相关的蛋白 / 代谢物（如降压药治疗后血管紧张素 II 浓度下降、抗炎药治疗后 IL-6 浓度降低），评估药物疗效，建立 PK-PD 关联模型。

药物毒性评估：通过代谢组学分析（LC-MS/MS）检测动物或细胞样本中的毒性相关代谢物（如肝损伤标志物胆红素、肾损伤标志物肌酐），早期发现药物对肝脏、肾脏的毒性；定量应激相关蛋白（如热休克蛋白 HSP70），评估药物对细胞的应激损伤。

药物靶点验证：定量药物靶点蛋白（如酶、受体）的表达量与活性（如激酶活性），验证靶点与疾病的关联性（如靶点蛋白高表达与肿瘤增殖相关）；检测药物处理后靶点下游蛋白 / 代谢物的变化（如抑制 PI3K 后 AKT 磷酸化水平下降），确认药物作用通路。

（三）基础科研与农业 / 食品领域

生命科学机制研究：

蛋白质组学分析：通过 LC-MS/MS 定量正常与疾病样本（如正常肝细胞 vs 肝癌细胞）中的差异表达蛋白，筛选疾病相关蛋白（如癌基因、抑癌蛋白），揭示疾病发生机制；

代谢组学分析：通过 GC-MS/LC-MS/MS 分析细胞、组织或体液中的代谢物变化（如缺氧条件下糖酵解代谢物乳酸升高），解析代谢通路调控机制（如 Warburg 效应）。

农业与畜牧业应用：

作物抗逆研究：定量作物在干旱、盐碱胁迫下的抗逆相关蛋白（如脯氨酸合成酶）与代谢物（如脯氨酸、甜菜碱），评估作物抗逆能力；

畜禽健康监测：检测畜禽血清中的炎症因子（如 IL-1β）与代谢指标（如葡萄糖、甘油三酯），评估畜禽健康状态；通过 LC-MS/MS 检测饲料中的霉菌毒素（如黄曲霉素），保障饲料安全。

食品质量控制：通过 HPLC 或 LC-MS/MS 定量食品中的营养成分（如维生素、氨基酸）、添加剂（如防腐剂）与污染物（如重金属、农药残留），确保食品营养与安全（如检测牛奶中的三聚氰胺、果蔬中的有机磷农药）。

三、实验流程与周期

（一）蛋白定量通用流程（以 ELISA 与 LC-MS/MS 为例）

1. ELISA 定量单一蛋白（如 IL-6）

样本预处理（0.5 天）：

血清 / 血浆样本：室温静置 30 min 后离心（3000 rpm，10 min），去除溶血与杂质；细胞培养上清直接离心（12000 rpm，5 min）去除细胞碎片；

组织样本：加入裂解液（含蛋白酶抑制剂）匀浆，离心（12000 rpm，15 min，4℃）取上清，测定蛋白总浓度（如 BCA 法），确保样本稀释后浓度在试剂盒线性范围内。 

ELISA 检测（1 天）：

试剂准备：试剂盒室温平衡 30 min，配制标准品浓度梯度（如 0、10、20、40、80、160 pg/mL）与样本稀释液；

加样与孵育：将标准品、对照与样本加入包被抗体的酶标板，37℃孵育 60 min；洗板后加入酶标记二抗，37℃孵育 30 min；再次洗板后加入底物（如 TMB），避光孵育 15 min；

检测与计算：加入终止液，用酶标仪检测 450 nm 吸光度（OD 值），绘制标准曲线，反推样本中目标蛋白浓度。

2. LC-MS/MS 定量多蛋白（如蛋白质组学）

样本预处理与酶解（1-2 天）：

蛋白提取：样本加入裂解液（含尿素、蛋白酶抑制剂），超声破碎后离心取上清，BCA 法定量蛋白总浓度；

蛋白酶解：加入二硫苏糖醇（DTT）还原蛋白二硫键，碘乙酰胺（IAA）烷基化，胰蛋白酶 37℃酶解 12-16 h，生成肽段；

肽段纯化：用 C18 固相萃取柱去除盐类与杂质，真空干燥后用流动相复溶。

LC-MS/MS 检测与数据分析（1-2 天）：

液相分离：肽段通过反相色谱柱（如 C18 柱）分离，流动相梯度洗脱（乙腈 / 水，含 0.1% 甲酸）；

质谱检测：分离后的肽段进入质谱仪（如 QE-HF、TripleTOF），采用数据依赖采集（DDA）模式，检测肽段的母离子与子离子信号；

定量分析：通过 MaxQuant、Proteome Discoverer 等软件匹配数据库（如 UniProt），鉴定蛋白并基于肽段离子强度（如 LFQ、iBAQ 算法）计算蛋白相对或绝对浓度。

（二）代谢物定量通用流程（以 LC-MS/MS 为例）

样本预处理（1 天）：

样本采集与保存：血清 / 血浆样本采集后立即离心（3000 rpm，10 min），-80℃冷冻保存；组织样本液氮研磨后加入提取液（如甲醇 / 水 = 8:2，含内标）；

代谢物提取：样本涡旋混匀后超声提取 30 min（4℃），离心（12000 rpm，15 min，4℃）取上清；加入萃取剂（如氯仿）去除蛋白，再次离心后取上清，过 0.22 μm 滤膜去除杂质；

内标添加：提取过程中加入稳定同位素标记内标（如 ¹³C - 葡萄糖、²H - 苯丙氨酸），用于校正提取效率与仪器误差。

LC-MS/MS 检测与数据分析（1 天）：

液相分离：根据代谢物极性选择色谱柱（如极性代谢物用 HILIC 柱，脂质用 C18 柱），流动相梯度洗脱（如乙腈 / 水，含 0.1% 甲酸或氨水）；

质谱检测：采用多反应监测模式（MRM），监测目标代谢物与内标的特征离子对（如葡萄糖 m/z 181→89，内标 ¹³C - 葡萄糖 m/z 188→96），记录离子强度；

定量计算：绘制内标校正的标准曲线（代谢物浓度 vs 离子强度比值），代入样本的离子强度比值，计算代谢物浓度。

（三）实验周期

单一蛋白 / 代谢物定量（如 ELISA、HPLC）：2-3 个工作日（样本预处理 0.5 天，检测 1 天，数据分析 0.5 天）；

多蛋白定量（如 LC-MS/MS 蛋白质组学）：5-7 个工作日（样本酶解 1-2 天，LC-MS/MS 检测 1 天，数据分析 2-3 天）；

多代谢物定量（如 LC-MS/MS 代谢组学）：4-6 个工作日（样本提取 1 天，LC-MS/MS 检测 1 天，数据分析 2-3 天）；

复杂样本（如组织、低丰度目标）：额外增加 1-2 天（需优化提取方法，提高回收率；低丰度目标需增加检测时间或富集步骤）。

四、客户需提供的样本信息

（一）核心样本与检测需求

样本类型与基础信息：

样本类型：明确样本来源（如血清、血浆、组织、细胞、细胞培养上清、尿液、脑脊液、食品）；不同样本处理方式差异大（如血浆需注明抗凝剂类型：EDTA / 肝素，避免影响检测；组织需区分新鲜 / 冷冻 / FFPE）；

样本状态：说明样本保存条件（如新鲜样本 4℃保存＜24 h，冷冻样本 - 80℃保存，避免反复冻融）、质量情况（如血清是否溶血 / 高脂 —— 溶血会干扰 ELISA 显色，高脂会影响代谢物提取）；

样本量：提供足量样本（如血清≥200 μL / 检测指标，组织≥50 mg，细胞≥1×10⁶个），满足预处理与重复检测需求；若样本量不足（如微量穿刺组织），需提前告知，以便调整实验方案（如使用微量提取试剂盒）。

检测目标与技术选择：

检测目标：明确目标蛋白 / 代谢物名称（如 “定量 IL-6 蛋白”“定量葡萄糖、乳酸代谢物”“定量肿瘤标志物 CEA、CA125”）；若为组学分析（如蛋白质组学、代谢组学），需说明分析范围（如 “检测血清中所有可检测的分泌蛋白”“分析肝脏组织的中央碳代谢通路代谢物”）；

技术偏好：指定检测技术（如 “ELISA 定量 IL-6”“LC-MS/MS 定量多代谢物”“Western Blot 半定量 EGFR 蛋白”），或委托实验方推荐（如单一目标优先 ELISA/HPLC，多目标优先 LC-MS/MS）；

定量要求：明确定量类型（相对定量 / 绝对定量）、检测限需求（如 “IL-6 检测限≤5 pg/mL”“代谢物检测限≤1 ng/mL”）；绝对定量需提供标准品（或委托实验方购买）。

实验设计与背景信息：

分组信息：说明样本分组（如 “对照组、疾病组、药物处理组”“不同生长阶段的作物样本”）、每组样本数量（如每组 3-6 个生物学重复，确保统计有效性）；

背景信息：提供样本相关背景（如 “人血清样本来自糖尿病患者与健康人，用于比较胰岛素浓度差异”“细胞样本经药物处理 24 h，用于检测凋亡相关蛋白表达”）；食品样本需说明检测目的（如 “检测牛奶中的三聚氰胺”“分析果蔬中的维生素 C 含量”）。

（二）信息要求细则

样本预处理说明：若客户已进行部分处理（如组织匀浆、蛋白提取、代谢物萃取），需提供预处理方法（如裂解液配方、离心条件、提取试剂），避免重复处理导致样本损耗或检测偏差；

干扰因素说明：告知样本中可能存在的干扰物质（如 “血清样本来自接受肝素治疗的患者”“食品样本含高浓度盐分”），实验方可提前优化方法（如使用肝素酶去除肝素干扰）；

特殊需求说明：

临床样本：需说明是否符合伦理要求（如提供知情同意书），是否需要符合临床检测规范（如 CLIA/ISO 15189）；

组学分析：需说明数据格式要求（如蛋白质组学需提供 FASTA 数据库，代谢组学需指定数据库匹配（如 HMDB、METLIN））；

报告要求：需说明是否需要统计分析（如 t 检验、方差分析）、图表类型（如热图、箱线图）。

五、交付内容及增值服务

（一）基础交付

定量检测报告：

基础信息：样本编号、类型、接收时间，检测目标（蛋白 / 代谢物名称）、技术方法（如 “ELISA（双抗体夹心法）”“LC-MS/MS（MRM 模式）”）、仪器型号（如酶标仪：BioTek Synergy H1；质谱仪：Thermo Q Exactive）；

实验数据：

质控数据：标准曲线图表（含拟合方程、R² 值，如 ELISA 标准曲线 R²＞0.99）、内标回收率（如代谢物内标回收率 80%-120%）、重复性数据（批内 CV＜10%、批间 CV＜15%）；

定量结果：每个样本的目标蛋白 / 代谢物浓度值（如 “样本 1 IL-6 浓度：25.3 pg/mL”“样本 2 葡萄糖浓度：5.6 mmol/L”），组学分析提供相对丰度矩阵或绝对浓度矩阵；

结论与解读：结合实验设计解读结果（如 “疾病组 IL-6 浓度显著高于对照组（P＜0.01），提示炎症激活”“药物处理组乳酸浓度下降，表明糖酵解通路受抑制”），标注检测局限性（如 “未检测到低丰度目标，可能低于检测限”）。

原始数据与文件：

检测原始数据：ELISA 的酶标仪 OD 值原始文件、Western Blot 的灰度扫描数据、LC-MS/MS 的原始质谱文件（如.raw、.wiff 文件）；

分析文件：标准曲线拟合原始数据、定量计算过程文件、组学分析的数据库匹配结果（如蛋白质鉴定报告、代谢物匹配报告）；

质控文件：试剂质检报告（如 ELISA 试剂盒批号、标准品纯度报告）、仪器校准记录（如质谱仪调谐报告、酶标仪校准证书）。

剩余样本与试剂：

剩余样本：预处理后的样本（如蛋白提取液、代谢物萃取液）或未用完的原始样本，-80℃保存 1 个月，便于复检；

剩余试剂：未用完的标准品、试剂盒组分（按说明书保存），如需可返还客户。

（二）增值服务

高级数据分析与可视化：

统计分析：针对分组样本进行统计检验（如 t 检验、ANOVA、主成分分析 PCA、偏最小二乘判别分析 PLS-DA），筛选差异表达蛋白 / 代谢物（如设定 fold change＞2 且 P＜0.05 为差异标准）；

通路分析：基于差异蛋白 / 代谢物进行通路富集分析（如使用 KEGG、GO 数据库分析差异蛋白富集的信号通路，如 PI3K-AKT 通路；使用 MetaboAnalyst 分析差异代谢物富集的代谢通路，如三羧酸循环）；

可视化图表：生成热图（展示样本间蛋白 / 代谢物表达模式）、火山图（展示差异蛋白 / 代谢物分布）、箱线图（展示组间浓度差异）、通路图（标注差异分子在通路中的位置）。

技术优化与定制服务：

检测方法开发：针对特殊目标（如新型蛋白、稀有代谢物）开发定制化定量方法（如筛选 ELISA 抗体配对、优化 LC-MS/MS 的色谱与质谱参数、验证方法的灵敏度与特异性）；

样本预处理优化：针对复杂样本（如高盐食品、富含杂质的组织）优化提取方法（如开发固相萃取 - 质谱联用方法去除杂质，提高目标分子回收率）；

技术培训：提供实验操作培训（如 ELISA 操作、LC-MS/MS 样本预处理、Western Blot 操作）、数据分析培训（如使用 MaxQuant 分析蛋白质组数据、使用 XCMS 分析代谢组数据），适合科研人员或技术人员。

科研与应用支持：

实验方案设计：基于客户科研目标（如 “研究某药物对肿瘤代谢的影响”“筛选糖尿病诊断的代谢标志物”），设计完整实验方案（如确定检测指标、样本量、分组方式、检测时间点）；

标志物筛选：结合多组学数据（如蛋白质组 + 代谢组），筛选疾病诊断或疗效预测的潜在标志物（如筛选肺癌早期诊断的血清蛋白标志物、糖尿病并发症预测的代谢标志物），并进行验证；

学术支持：协助撰写实验方法与结果部分（符合 SCI 论文规范），提供技术文献引用建议，协助解答审稿人关于定量方法的疑问。

六、技术优势

（一）高灵敏度与特异性，满足微量与复杂样本需求

高灵敏度：主流技术检测限低，ELISA 可检测 pg/mL 级蛋白（如 IL-6 检测限≤1 pg/mL），LC-MS/MS 可检测 ng/mL 至 pg/mL 级代谢物（如激素、药物代谢产物），可捕获生物样本中低丰度目标分子（如血清中的微量细胞因子、组织中的稀有代谢物）；

高特异性：基于特异性相互作用（如 ELISA 的抗原 - 抗体结合、Western Blot 的抗体识别）或特征离子检测（如 LC-MS/MS 的 MRM 模式，仅检测目标分子的特征离子对），可区分结构相似的分子（如区分不同亚型的细胞因子 IL-6 与 IL-8，区分同分异构体代谢物），避免交叉反应导致的假阳性，准确性＞95%。

（二）灵活适配单目标与高通量需求

单目标快速定量：ELISA、HPLC 等技术操作简便、周期短（2-3 天），适合单一或少数目标的快速检测（如临床常规检测肿瘤标志物、炎症因子），成本较低，可批量处理样本（如 ELISA 一次检测 96 个样本）；

高通量组学分析：LC-MS/MS 可同时定量数百种蛋白（如蛋白质组学一次分析 1000 + 蛋白）或代谢物（如代谢组学一次分析 500 + 代谢物），无需提前知道目标分子，适合发现新的差异分子或标志物（如疾病相关的未知差异蛋白 / 代谢物），为机制研究提供全景视角。

（三）定量准确性与重复性高，结果可靠

准确性保障：通过标准品校准（绝对定量）或内标校正（相对定量）确保准确性，如 ELISA 使用梯度浓度标准品绘制标准曲线，LC-MS/MS 添加稳定同位素内标校正提取效率与仪器误差，回收率控制在 80%-120%；

重复性好：标准化操作流程（如样本预处理 SOP、仪器参数固定）与严格质控（如设置空白对照、阳性对照、重复样本），确保批内重复性 CV＜10%、批间重复性 CV＜15%，不同实验室使用相同方法可获得一致结果，满足多中心研究或临床质控要求。

（四）样本兼容性广，跨领域应用能力强

多样本类型适配：可处理生物样本（血清、组织、细胞、体液）、食品样本（牛奶、果蔬、饲料）、环境样本（水体、土壤），仅需根据样本特性调整预处理方法（如组织需匀浆、食品需去脂）；

跨领域应用：覆盖医学（临床诊断、药物研发）、生命科学（基础科研）、农业（作物研究、畜禽健康）、食品（质量控制）、环境（污染物检测）等领域，如医学中定量肿瘤标志物、农业中定量作物抗逆代谢物、食品中定量营养成分，应用场景灵活多样。