一、实验简介

临床样本 DNA/RNA 提取是指从人体来源的临床样本（如血液、组织、体液、细胞）中，通过物理裂解、化学分离或酶解等方法，去除蛋白质、脂质、多糖等杂质，纯化获得高纯度、高完整性核酸（DNA 或 RNA）的核心技术。其核心原理基于 “核酸与杂质的理化性质差异”—— 利用核酸在特定溶液（如裂解液、离心柱结合液）中的溶解性、吸附性差异，通过裂解（破坏细胞 / 组织结构释放核酸）、纯化（去除杂质）、洗脱（获得纯净核酸）三步关键流程，实现核酸分离。

DNA 提取：针对样本中的基因组 DNA（gDNA）、线粒体 DNA（mtDNA）或病毒 DNA，通过蛋白酶 K 消化蛋白质、酚 - 氯仿抽提或离心柱吸附（如硅胶膜特异性结合 DNA），去除 RNA 污染（添加 RNase），最终获得可用于 PCR、基因测序、基因分型的纯净 DNA；

RNA 提取：针对样本中的总 RNA（含 mRNA、rRNA、tRNA）或特定 RNA（如 mRNA、microRNA），通过胍盐（如异硫氰酸胍）抑制 RNA 酶活性（防止 RNA 降解）、酚 - 氯仿分层分离 RNA（RNA 溶于水相）或离心柱纯化，去除 DNA 污染（添加 DNase），最终获得可用于 RT-PCR、RNA 测序、Northern blot 的完整 RNA。

该技术是临床分子诊断（如新冠病毒核酸检测、肿瘤基因检测）、药物研发（如伴随诊断靶点筛选）、基础医学研究（如基因表达分析）的 “上游核心环节”，核酸的纯度与完整性直接决定下游实验（如测序、PCR）的成败，需严格遵循标准化操作与质量控制流程。

二、核心应用场景

（一）临床分子诊断与疾病筛查

感染性疾病核酸检测：

病毒检测：从鼻咽拭子、血液、脑脊液中提取病毒 RNA/DNA（如新冠病毒 RNA、乙肝病毒 DNA、HPV 病毒 DNA），用于病毒定性（是否感染）与定量（病毒载量）检测，指导抗病毒治疗（如乙肝病毒 DNA 载量＞10⁶ copies/mL 需启动抗病毒治疗）；

细菌 / 真菌检测：从脓液、痰液、组织中提取病原菌 DNA（如结核分枝杆菌 DNA、念珠菌 DNA），通过 PCR 或测序明确病原菌种类，解决传统培养法 “耗时长、阳性率低” 的问题（如结核分枝杆菌培养需 4-6 周，DNA 提取后 PCR 检测 1-2 天出结果）。

肿瘤分子分型与靶向治疗：

肿瘤驱动基因突变检测：从肿瘤组织（手术 / 穿刺组织）、血液（循环肿瘤 DNA ctDNA）中提取 DNA，检测基因突变（如肺癌 EGFR 突变、乳腺癌 HER2 基因突变、结直肠癌 KRAS 突变），明确肿瘤分子分型，筛选适合靶向治疗的患者（如 EGFR 突变患者使用 EGFR 抑制剂）；

肿瘤融合基因检测：从肿瘤组织中提取 RNA，通过 RT-PCR 或 RNA 测序检测融合基因（如非小细胞肺癌 ALK 融合、白血病 BCR-ABL 融合），为靶向药物选择提供依据（如 ALK 融合患者使用 ALK 抑制剂）。

遗传病与产前诊断：

遗传病基因检测：从外周血中提取 DNA，检测遗传病相关基因突变（如地中海贫血 α/β 珠蛋白基因突变、囊性纤维化 CFTR 基因突变），用于遗传病筛查（如新生儿筛查）与确诊；

产前诊断（NIPT）：从孕妇外周血中提取胎儿游离 DNA（cffDNA），检测胎儿染色体异常（如 21 三体综合征、18 三体综合征），实现无创、安全的产前筛查（避免羊水穿刺的流产风险）。

（二）药物研发与伴随诊断

药物靶点验证：从临床样本（如患者肿瘤组织、血液）中提取 DNA/RNA，分析靶点基因的突变（如 PD-1 基因多态性）、表达水平（如 PD-L1 mRNA 表达），验证靶点与疾病的关联性，为药物研发提供临床依据；

伴随诊断试剂开发：为伴随诊断试剂盒（如肿瘤靶向药伴随诊断）提供标准核酸样本（如已知 EGFR 突变的 DNA 样本、ALK 融合的 RNA 样本），用于试剂盒的灵敏度、特异性验证；

药物疗效监测：治疗前后从患者样本中提取核酸，检测靶点基因变化（如靶向治疗后 EGFR 突变丰度下降、病毒治疗后 HBV DNA 载量降低），量化药物疗效，指导剂量调整。

（三）基础医学研究

基因表达分析：从正常与疾病样本（如正常肝组织 vs 肝癌组织）中提取 RNA，通过 RT-qPCR、RNA 测序分析差异基因表达（如癌基因 MYC mRNA 上调、抑癌基因 p53 mRNA 下调），揭示疾病发生机制；

表观遗传学研究：从样本中提取 DNA，用于 DNA 甲基化（如 CpG 岛甲基化）、组蛋白修饰检测，分析表观遗传调控对疾病的影响（如肿瘤抑制基因甲基化导致表达沉默）；

微生物组研究：从粪便、口腔拭子等样本中提取微生物 DNA，通过 16S rRNA 基因测序或宏基因组测序，分析肠道 / 口腔微生物群落结构，研究微生物与疾病（如肠炎、肥胖）的关联。

三、实验流程与周期

（一）DNA 提取通用流程（以离心柱法为例）

样本预处理（0.5-1 天）：

组织样本：新鲜 / 冰冻组织（如肿瘤穿刺组织）用液氮研磨或组织匀浆机破碎，加入裂解液（含蛋白酶 K），56℃孵育 1-3 h（根据组织硬度调整，如肝组织 1 h、骨组织 3 h），彻底消化蛋白质与组织碎片；

血液样本：全血样本加入红细胞裂解液，室温孵育 10 min 后离心（3000 rpm，5 min），去除红细胞，保留白细胞沉淀；血浆 / 血清样本（提取 ctDNA）需先通过离心富集游离 DNA（如 12000 rpm，10 min）；

体液样本：脑脊液、尿液等体液样本需先离心（5000 rpm，10 min）去除细胞碎片，若样本量少（＜1 mL），需用核酸富集柱浓缩。

核酸纯化（0.5 天）：

裂解与结合：向预处理后的样本中加入结合液（如高盐缓冲液），调节 pH 值，使 DNA 特异性结合到离心柱的硅胶膜上；

洗涤去杂质：依次加入洗涤液 1（去除蛋白质）、洗涤液 2（去除盐类、残留杂质），每次洗涤后离心（12000 rpm，1 min），弃去废液；

洗脱 DNA：向离心柱中加入无 RNase 的洗脱缓冲液（如 TE 缓冲液、无酶水），室温静置 2 min 后离心（12000 rpm，2 min），收集洗脱液，获得纯净 DNA。

质量检测（0.5 天）：

纯度检测：通过紫外分光光度计（Nanodrop）检测 DNA 的 A260/A280 比值（1.8-2.0 为纯度合格，＜1.8 提示蛋白质污染，＞2.0 提示 RNA 污染）；

完整性检测：通过琼脂糖凝胶电泳（1% 凝胶）检测 DNA 片段大小（基因组 DNA 应呈现清晰的高分子量条带，无明显拖尾，提示完整性好）；

浓度检测：通过 Nanodrop 或 Qubit 荧光定量仪检测 DNA 浓度（临床诊断需浓度≥20 ng/μL，满足下游 PCR 需求）。

（二）RNA 提取通用流程（以胍盐 - 离心柱法为例）

样本预处理与裂解（0.5-1 天）：

细胞 / 组织样本：新鲜样本立即加入含 RNA 酶抑制剂（如 RNasin）的裂解液（如 TRIzol 试剂），组织需匀浆破碎，室温孵育 5 min，使 RNA 酶失活并释放 RNA；

体液样本：唾液、脑脊液等样本需加入裂解液后离心（12000 rpm，10 min），去除细胞碎片，若 RNA 含量低，需用 RNA 富集柱浓缩；

避免 RNA 降解：全程使用无 RNA 酶耗材（如无酶离心管、枪头），操作环境需用 RNA 酶清除剂处理，防止外源性 RNA 酶污染。

核酸纯化（0.5 天）：

分层分离：向裂解液中加入氯仿，剧烈振荡后离心（12000 rpm，15 min，4℃），样本分层为有机相（蛋白质、脂质）、中间相（DNA）、水相（RNA），吸取水相（避免接触中间相）；

结合与洗涤：向水相中加入异丙醇沉淀 RNA，离心（12000 rpm，10 min，4℃）获得 RNA 沉淀；用 75% 乙醇洗涤沉淀（去除盐类），离心后弃去乙醇，晾干沉淀；

洗脱 RNA：加入无 RNA 酶的洗脱液（如无酶水）溶解 RNA，获得纯净 RNA。

质量检测（0.5 天）：

纯度检测：Nanodrop 检测 A260/A280 比值（1.9-2.1 为纯度合格，＜1.9 提示蛋白质污染）、A260/A230 比值（＞2.0 为合格，＜2.0 提示盐类污染）；

完整性检测：通过琼脂糖凝胶电泳（1% 变性凝胶）或 Agilent 2100 生物分析仪检测 RNA 完整性（总 RNA 应清晰显示 28S、18S rRNA 条带，28S/18S 亮度比≈2:1，RIN 值＞7.0 为完整性好）；

浓度检测：Qubit 荧光定量仪检测 RNA 浓度（RNA 测序需浓度≥50 ng/μL，RIN 值＞8.0）。

（三）实验周期

标准样本（单类型样本，≤20 个）：

DNA 提取（如血液、常规组织）：2-3 个工作日（预处理 0.5-1 天，纯化 0.5 天，质量检测 0.5 天）；

RNA 提取（如新鲜组织、细胞）：2-3 个工作日（需额外注意 RNA 酶抑制，操作时间与 DNA 提取相近）；

复杂样本（特殊类型或大样本量）：

特殊样本（如骨组织、FFPE 组织、低丰度 ctDNA）：额外增加 1-2 天（骨组织需脱钙处理，FFPE 组织需脱蜡与核酸修复，ctDNA 需富集）；

大样本量（≥96 个样本）：4-5 个工作日（需批量处理，分批次纯化与检测）；

临床诊断级提取（需符合 CLIA/ISO 15189 规范）：额外增加 1 天（需双人核对、质量记录存档、结果报告审核）。

四、客户需提供的样本信息

（一）核心样本与提取需求 

样本类型与基础信息：

样本类型：明确样本来源（如外周血、肿瘤组织、鼻咽拭子、脑脊液、粪便、FFPE 组织）；不同样本处理方式差异大（如血液需区分全血 / 血浆 / 血清，组织需区分新鲜 / 冰冻 / FFPE）；

样本状态：说明样本保存条件（如新鲜样本 4℃保存＜24 h，冰冻样本 - 80℃保存，FFPE 组织室温保存）、保存时长（如冰冻组织保存＜6 个月，避免反复冻融）、是否存在特殊情况（如血液溶血、组织自溶、FFPE 组织脱蜡不彻底）；

样本量：提供样本量（如全血 2 mL、肿瘤组织 50 mg、鼻咽拭子 1 支），需满足最低提取需求（如 DNA 提取需全血≥0.5 mL，RNA 提取需新鲜组织≥20 mg）；若样本量不足，需提前告知，以便调整提取方案（如使用微量提取试剂盒）。

提取目标与下游应用：

核酸类型：明确提取 DNA 或 RNA；若为 DNA，需说明是否提取基因组 DNA（gDNA）、循环肿瘤 DNA（ctDNA）或病毒 DNA；若为 RNA，需说明是否提取总 RNA、mRNA 或 microRNA；

下游实验需求：告知下游应用场景（如 PCR 检测、基因测序、RT-qPCR、Northern blot），不同应用对核酸质量要求不同（如 PCR 需 DNA 纯度 A260/A280≈1.8，RNA 测序需 RNA RIN 值＞8.0）；

特殊要求：如提取 ctDNA 需去除白细胞污染（避免基因组 DNA 干扰）、提取 mRNA 需用 Oligo (dT) 磁珠富集、提取 FFPE 组织 RNA 需进行核酸修复（去除甲醛交联）。

质量控制与交付要求： 

质量标准：明确核酸纯度（如 DNA A260/A280 1.8-2.0）、完整性（如 RNA RIN 值＞7.0）、浓度（如 DNA 浓度≥20 ng/μL，RNA 浓度≥10 ng/μL）要求；

交付形式：指定核酸洗脱液类型（如无酶水、TE 缓冲液）、保存容器（如无酶离心管、冻存管）、交付数量（如提取后分 2 管保存，每管 50 μL）；

临床合规要求：若为临床诊断用样本，需说明是否需符合 CLIA、ISO 15189 或中国《临床基因扩增检验实验室管理办法》，是否需提供溯源记录与质量报告。

（二）信息要求细则

样本预处理说明：

已预处理样本：若客户已进行部分处理（如血液分离血浆、组织匀浆），需提供预处理方法（如血浆分离离心条件：3000 rpm，10 min），避免重复处理或处理不当；

特殊预处理需求：如骨组织需提前脱钙（使用 EDTA 脱钙液）、FFPE 组织需脱蜡（使用二甲苯脱蜡），需告知是否已完成，未完成则由实验方处理（额外增加时间）。

污染控制要求：

避免交叉污染：若样本为传染病样本（如新冠病毒阳性样本、HIV 阳性样本），需提前告知，实验方将在生物安全柜中操作，使用专用耗材，避免污染其他样本；

内源性污染去除：如提取 RNA 需去除 DNA 污染（添加 DNase 处理）、提取 DNA 需去除 RNA 污染（添加 RNase 处理），需明确告知是否需要额外去污染步骤。

紧急需求说明：

若为急诊样本（如临床抢救需快速提取核酸），需说明紧急程度（如 24 小时内完成提取与检测），实验方将优先处理，缩短周期（如 1 个工作日完成标准样本提取）。

五、交付内容及增值服务

（一）基础交付

纯化后的核酸样本：

核酸制品：按客户要求分装（如每管 50-100 μL），用无酶冻存管保存，标注样本编号、核酸类型（DNA/RNA）、浓度、纯度、提取日期；

保存与运输：短期保存（＜1 周）4℃运输，长期保存（＞1 周）-80℃冷冻运输，运输时使用干冰或冰袋，避免核酸降解；RNA 样本需额外加入 RNA 酶抑制剂，确保运输过程中不降解。

完整提取报告：

样本信息：样本编号、类型（如外周血、肿瘤组织）、原始样本量、保存条件、预处理步骤（如组织匀浆、血液离心）；

提取方法：使用的试剂盒品牌与批号（如 Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit）、提取流程（如离心柱法、磁珠法）、关键步骤参数（如裂解温度 56℃、孵育时间 2 h）；

质量检测结果：

纯度数据：DNA A260/A280、A260/A230 比值，RNA A260/A280、A260/A230 比值及 RIN 值（若检测）；

浓度数据：Nanodrop 或 Qubit 检测的核酸浓度（如 DNA 浓度 35 ng/μL，总产量 700 ng）；

完整性验证：琼脂糖凝胶电泳图（标注 DNA 条带大小、RNA 28S/18S 条带）；

结论：核酸质量是否符合下游实验要求（如 “DNA 纯度 A260/A280=1.92，浓度 35 ng/μL，符合 PCR 检测需求”）。

原始记录与质控文件：

操作记录：提取过程原始数据（如离心时间、温度，孵育时长）、试剂使用记录（试剂盒批号、有效期）；

质控报告：仪器校准记录（Nanodrop、离心机校准证书）、阴性对照结果（如空白提取无核酸，排除交叉污染）；

溯源文件：若为临床样本，提供样本接收与处理溯源表（双人核对签名），符合临床合规要求。

（二）增值服务

核酸质量优化与定制处理：

低质量核酸修复：针对降解核酸（如 FFPE 组织 RNA、长期保存的 DNA），使用核酸修复试剂盒（如去除 DNA 断裂末端、修复 RNA 交联），提升完整性（如 RNA RIN 值从 6.0 提升至 7.5）；

微量核酸富集：针对低丰度样本（如 ctDNA、单细胞 RNA），使用磁珠富集或滚环扩增（RCA）技术，提高核酸浓度（如 ctDNA 浓度从 5 ng/μL 提升至 20 ng/μL），满足下游测序需求；

去污染处理：针对高杂质样本（如粪便 DNA 含多糖、血液 RNA 含血红蛋白），通过额外纯化步骤（如蛋白酶 K 二次消化、多糖去除柱），降低杂质含量（如 DNA A260/A280 从 1.5 提升至 1.8）。

下游实验衔接与技术支持：

核酸预处理：根据下游实验需求，提供核酸预处理服务（如 DNA 酶切、RNA 逆转录为 cDNA、mRNA 反转录为文库），直接交付可用于实验的模板（如 PCR 模板 cDNA）；

实验方案设计：结合提取的核酸质量，为下游实验（如 PCR、测序）设计方案（如根据 DNA 浓度调整 PCR 引物浓度，根据 RNA 完整性选择测序平台）；

技术培训：提供核酸提取操作培训（样本处理、试剂使用、污染控制）、质量检测仪器（Nanodrop、Qubit）操作培训，适合临床实验室或科研团队。

临床与科研支持：

临床诊断报告辅助：为临床样本提取结果提供解读（如 “RNA RIN 值 = 6.5，适合 RT-PCR 检测，不建议用于全长 RNA 测序”），协助临床医生判断下游检测可行性；

科研数据整合：为批量科研样本（如 100 例肿瘤组织）提供核酸质量统计分析（如纯度分布、浓度均值），结合样本临床信息（如肿瘤分期），生成质量分析报告；

合规支持：为临床诊断用提取服务提供合规文件（如方法学验证报告、室内质控记录），协助实验室通过 CLIA、ISO 15189 认证。

六、技术优势

（一）高纯度与完整性，保障下游实验可靠性

通过标准化裂解、纯化流程（如离心柱法特异性结合核酸、蛋白酶 K 彻底消化蛋白质、RNA 酶 / DNA 酶定向去污染），可获得高纯度核酸（DNA A260/A280 1.8-2.0，RNA A260/A280 1.9-2.1），无蛋白质、盐类、有机溶剂残留；针对易降解样本（如 RNA、FFPE 组织核酸），通过 RNA 酶抑制剂、核酸修复技术，可保持核酸完整性（RNA RIN 值＞7.0，DNA 无明显拖尾），避免因核酸质量差导致下游 PCR 失败、测序数据低质。

（二）适配多样化临床样本，应用范围广

可处理几乎所有临床样本类型：① 血液类（全血、血浆、血清、脐带血）；② 组织类（新鲜组织、冰冻组织、FFPE 组织、骨组织、穿刺组织）；③ 体液类（脑脊液、尿液、唾液、胸腹水）；④ 分泌物 / 排泄物类（鼻咽拭子、粪便、痰液）；针对不同样本特性定制提取方案（如 FFPE 组织脱蜡修复、骨组织脱钙、ctDNA 富集），解决特殊样本提取难题（如 FFPE 组织 RNA 降解严重、粪便样本杂质多）。

（三）标准化与自动化，结果可重复且效率高

采用商品化试剂盒（如 Qiagen、Thermo Fisher 试剂盒）与标准化操作流程（SOP），减少人为操作误差；支持自动化提取（如使用 KingFisher、MagNA Pure 自动化核酸提取仪），实现 96 孔板高通量处理，日均可提取数百个样本，且批内、批间重复性好（核酸浓度 CV＜10%，纯度 CV＜5%）；临床级提取严格遵循 CLIA/ISO 15189 规范，全程溯源，满足临床诊断的合规要求。

（四）兼顾灵敏度与特异性，满足低丰度核酸需求

针对低丰度核酸样本（如血浆 ctDNA、脑脊液病毒 RNA、单细胞核酸），通过磁珠富集、滚环扩增等技术，可从微量样本（如 100 μL 血浆、1 个细胞）中提取到足量核酸（浓度≥10 ng/μL）；同时通过特异性结合（如硅胶膜只结合 DNA、Oligo (dT) 磁珠只结合 mRNA），排除非目标核酸干扰（如提取 mRNA 时去除 rRNA），满足下游高灵敏度检测（如数字 PCR、单细胞测序）需求。