一、实验简介

免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）与原位杂交（In Situ Hybridization, ISH）是两种在组织或细胞水平定位特定生物分子的核心病理检测技术，均通过 “特异性结合 - 信号放大 - 可视化” 流程实现目标分子的原位分析，但检测对象与原理存在核心差异：

免疫组化（IHC）：基于 “抗原 - 抗体特异性结合” 原理，使用标记有荧光素、酶（如辣根过氧化物酶 HRP）或金属颗粒的特异性抗体，与组织 / 细胞中的目标蛋白（如肿瘤标志物 PD-L1、激素受体 ER/PR）结合；通过酶促反应（如 DAB 显色）或荧光信号放大，在显微镜下观察目标蛋白的表达位置（如细胞膜、细胞质、细胞核）与表达强度，实现蛋白水平的定性与半定量分析。

原位杂交（ISH）：基于 “核酸碱基互补配对” 原理，使用标记有荧光素、地高辛或放射性同位素的核酸探针（DNA 或 RNA 探针），与组织 / 细胞中的目标核酸（如特定基因片段、mRNA、microRNA）结合；通过信号放大系统（如酪胺信号放大 TSA）增强检测灵敏度，在原位显示目标核酸的分布与丰度，实现基因水平的定位与定量分析（如检测 HER2 基因扩增、HPV 病毒整合位点）。

两种技术均能保留组织细胞的形态学背景，明确目标分子与病理结构的关联，是疾病诊断（如肿瘤分型）、靶点检测（如免疫治疗标志物 PD-L1）、预后评估（如 Ki-67 增殖指数）的关键工具，广泛应用于临床病理诊断、药物研发伴随诊断及基础医学研究。

二、核心应用场景

（一）临床病理诊断与分型

肿瘤诊断与亚型区分：

IHC：通过检测肿瘤标志物（如 CK7/CK20 区分腺癌与鳞癌、CD45 区分 hematopoietic 肿瘤、GFAP 诊断神经胶质肿瘤），明确肿瘤起源与亚型（如肺腺癌 vs 肺鳞癌、弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 vs 滤泡淋巴瘤）；检测激素受体（ER/PR）、HER2 蛋白表达，为乳腺癌、子宫内膜癌等激素依赖性肿瘤分型提供依据。

ISH：通过检测特定基因异常（如 HER2 基因扩增（FISH 法）辅助乳腺癌 / 胃癌分型、ALK 基因融合（FISH/RNA-ISH）诊断非小细胞肺癌、MYC 基因扩增判断淋巴瘤恶性程度），弥补 IHC 在基因水平检测的局限（如 IHC 检测 HER2 蛋白表达阴性但 ISH 检测 HER2 基因扩增的 “HER2 假阴性” 病例）。

感染性疾病诊断：

IHC：检测病原体蛋白（如 HPV L1 蛋白、HBV 表面抗原、SARS-CoV-2 刺突蛋白），明确病原体感染及感染范围（如 HPV 感染宫颈上皮细胞的分布）。

ISH：直接检测病原体核酸（如 HPV DNA 分型、EBV mRNA、结核分枝杆菌 rRNA），在难以培养病原体（如结核杆菌）或蛋白表达量低的场景中（如早期病毒感染），提供更灵敏的诊断依据。

（二）药物研发与伴随诊断

免疫治疗标志物检测：

IHC：检测免疫检查点分子（如 PD-L1、CTLA-4）在肿瘤组织或免疫细胞中的表达（如 PD-L1 表达≥50% 为免疫治疗优势人群），筛选适合 PD-1/PD-L1 抑制剂治疗的患者；检测肿瘤浸润免疫细胞标志物（如 CD8+ T 细胞、Foxp3+ Treg 细胞），评估肿瘤免疫微环境，预测免疫治疗疗效。

ISH：检测肿瘤微环境中细胞因子 mRNA（如 IFN-γ mRNA、IL-6 mRNA）的分布，分析免疫激活状态；检测耐药相关基因（如 TMB 相关基因突变、JAK2 mRNA），预测免疫治疗耐药风险。

靶向治疗靶点验证：

IHC：检测小分子靶向药靶点蛋白（如 EGFR、ALK、ROS1）的表达，初步筛选潜在获益患者（如 EGFR 蛋白高表达提示可能适合 EGFR 抑制剂）。

ISH：检测靶点基因异常（如 EGFR 基因突变（RNA-ISH）、ALK 基因融合（FISH）、MET 基因扩增），明确靶向治疗的分子基础（如 ALK 融合阳性患者可使用 ALK 抑制剂），避免 IHC 假阳性 / 假阴性导致的治疗误判。

（三）预后评估与治疗监测

肿瘤预后指标检测：

IHC：检测细胞增殖标志物（如 Ki-67 指数，指数越高提示肿瘤增殖越快、预后越差）、凋亡相关蛋白（如 Bcl-2、Caspase-3）、血管生成标志物（如 CD31、VEGF），评估肿瘤恶性程度与患者预后（如 Ki-67 指数＞30% 提示乳腺癌预后不良）。

ISH：检测预后相关基因（如 TERT 基因扩增、p53 基因突变），预测肿瘤复发风险（如 TERT 扩增提示肝癌复发率升高）；检测微小残留病灶（MRD）中的肿瘤特异性 mRNA（如白血病融合基因 mRNA），监测治疗后残留肿瘤细胞，指导后续治疗。

治疗疗效监测：

IHC：治疗前后对比检测靶点蛋白表达（如化疗后 Ki-67 指数下降、靶向治疗后 EGFR 蛋白表达降低），评估治疗效果；检测耐药蛋白（如 ABC 转运体、MET 蛋白），早期发现治疗耐药。

ISH：治疗后检测目标基因变化（如 HER2 基因扩增消失、HPV DNA 载量下降），量化治疗对分子异常的逆转效果；检测治疗诱导的基因表达改变（如化疗后 p21 mRNA 上调），解析治疗机制。

（四）基础医学研究

分子机制探索：

IHC：分析目标蛋白在正常与疾病组织中的表达差异（如阿尔茨海默病脑组织中 Aβ 蛋白沉积、tau 蛋白磷酸化），定位蛋白在亚细胞结构中的分布（如核蛋白 p53 在应激条件下的核转位）。

ISH：研究基因在发育过程中的时空表达（如胚胎发育中 Hox 基因 mRNA 的动态分布）、疾病状态下基因表达重构（如糖尿病胰岛 β 细胞中 INS mRNA 表达下调），揭示分子事件与病理进程的关联。

药物作用机制验证：

IHC：检测药物处理后目标蛋白及下游通路蛋白的表达变化（如 MEK 抑制剂处理后 p-ERK 蛋白下调），验证药物对靶点通路的调控作用。

ISH：检测药物对目标基因转录的影响（如降脂药对 LDLR mRNA 表达的上调）、药物诱导的基因表达谱改变（如抗炎药对 IL-1β mRNA 的抑制），解析药物作用的分子环节。

三、实验流程与周期

（一）免疫组化（IHC）实验流程

样本预处理（1-2 天）：

组织固定与包埋：临床样本（如手术切除组织、穿刺组织）用 10% 中性福尔马林固定（24-48 h），梯度脱水后石蜡包埋，制成 4-5 μm 厚的组织切片；

脱蜡与抗原修复：切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，采用高温高压（柠檬酸盐缓冲液 pH 6.0）或蛋白酶消化（如胰蛋白酶）进行抗原修复，暴露被掩盖的抗原表位（避免甲醛固定导致的抗原交联）；

封闭与阻断：用 3% H₂O₂阻断内源性过氧化物酶活性（避免非特异性显色），5% BSA 封闭非特异性结合位点（减少抗体非特异性吸附）。

抗体孵育与信号检测（1 天）：

一抗孵育：加入特异性一抗（如抗 PD-L1 抗体、抗 ER 抗体），4℃孵育过夜或室温孵育 1-2 h（抗体浓度与孵育时间需根据抗体特性优化）；

二抗孵育：加入标记有 HRP 或荧光素的二抗（如羊抗兔 IgG-HRP），室温孵育 30-60 min，实现信号放大；

显色与复染：HRP 标记二抗用 DAB（3,3'- 二氨基联苯胺）显色（棕褐色沉淀），荧光标记二抗直接荧光成像；苏木素复染细胞核（蓝色），区分组织细胞结构。

封片与结果判读（0.5 天）：

脱水透明与封片：DAB 显色切片经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，用中性树胶封片；荧光切片用抗荧光淬灭封片剂封片（避免荧光衰减）；

结果判读：光学显微镜下观察目标蛋白的表达位置（细胞膜 / 质 / 核）与强度，按半定量标准评分（如 IHC 评分：0 分 = 无表达，1+= 弱表达，2+= 中度表达，3+= 强表达）。

（二）原位杂交（ISH）实验流程

样本预处理（1-2 天）：

组织固定与切片：同 IHC 流程（福尔马林固定、石蜡包埋切片）；

脱蜡与通透：脱蜡水化后，用蛋白酶 K 消化组织（37℃孵育 15-30 min），增加组织通透性，便于探针进入细胞与目标核酸结合；

预杂交：加入预杂交液（含鲑鱼精 DNA、甲酰胺），37-42℃孵育 30 min，封闭非特异性核酸结合位点。

探针杂交与信号放大（1-2 天）：

探针孵育：加入标记探针（如 HER2 DNA FISH 探针、HPV RNA 探针），按探针类型设置杂交温度（DNA 探针 42-45℃，RNA 探针 37-40℃），杂交过夜（16-20 h）；

洗片：用不同浓度的 SSC 缓冲液（如 2×SSC、0.1×SSC）梯度洗片，去除未结合的游离探针，降低背景信号；

信号放大：荧光标记探针可直接观察；非荧光探针（如地高辛标记）需加入标记二抗（如抗地高辛 - HRP）与信号放大系统（如 TSA），增强检测灵敏度。

信号检测与结果判读（0.5-1 天）：

信号可视化：荧光探针用荧光显微镜观察（如 FISH 检测 HER2 基因，红色信号为 HER2 基因，绿色信号为染色体着丝粒对照）；酶标记探针用显色剂（如 NBT/BCIP）显色（蓝色沉淀）；

结果判读：计数目标核酸信号（如 FISH 检测 HER2 基因，HER2 信号 / 着丝粒信号比值≥2.0 判定为基因扩增），或半定量分析信号强度（如 RNA-ISH 评分：0 = 无信号，1+= 弱信号，2+= 中信号，3+= 强信号）。

（三）实验周期

标准检测（单靶点，≤20 个样本）：

IHC：3-4 个工作日（样本预处理 1-2 天，抗体孵育与显色 1 天，判读 0.5 天）；

ISH：4-6 个工作日（样本预处理 1-2 天，探针杂交与信号放大 2-3 天，判读 0.5-1 天）；

复杂检测（多靶点、大样本量或特殊样本）：

多靶点检测（如同时检测 PD-L1、Ki-67）：每增加 1 个靶点，IHC 增加 1 天，ISH 增加 1-2 天；

特殊样本（如冰冻组织、骨组织脱钙）：需额外增加 1-2 天（冰冻组织需优化固定与抗原修复，骨组织需脱钙处理）；

临床诊断级检测（需病理医师审核报告）：额外增加 1-2 天（需双盲审核、报告签发）。

四、客户需提供的样本信息

（一）核心样本与检测需求

样本类型与质量：

1.组织样本：

石蜡组织块 / 切片：提供福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块（需注明固定时间≤48 h，避免过度固定导致抗原 / 核酸降解），或已制备的 4-5 μm 厚石蜡切片（≥3 张，防脱载玻片）；

2.新鲜组织 / 冰冻组织：新鲜手术 / 穿刺组织需用专用固定液（如 RNA later 保存 RNA、4% 多聚甲醛固定蛋白），冰冻组织需 - 80℃保存（避免反复冻融），并注明组织类型（如肺腺癌、乳腺组织）；

3.细胞样本：细胞爬片（≥3 张，防脱载玻片）、细胞涂片或细胞离心沉淀块，需注明细胞类型（如 A549 细胞、外周血单个核细胞）。

检测目标与抗体 / 探针信息：

1.IHC：明确目标蛋白名称（如 PD-L1、ER、Ki-67）、物种来源（如人源、鼠源）、所需抗体克隆号（如 PD-L1 抗体克隆号 28-8，ER 抗体克隆号 SP1）；若客户提供自备抗体，需提供抗体说明书（含宿主物种、稀释比例、推荐修复方法）；

2.ISH：明确目标核酸类型（DNA/RNA）、序列信息（如 HER2 基因、HPV16/18 型、IL-6 mRNA）、探针类型（如 FISH 探针、RNAscope 探针）；若检测特定病原体（如 EBV、结核杆菌），需注明病原体分型。

实验设计与判读标准：

明确检测目的（如临床诊断、科研探索、药物伴随诊断）；

判读标准要求：如 IHC 需半定量评分（如 H-score、阳性细胞百分比）、ISH 需明确阳性判定阈值（如 HER2 FISH 比值≥2.0 为扩增）；

对照设置：是否需设置阳性对照（如已知 PD-L1 阳性的肿瘤组织）、阴性对照（如正常组织或 IgG 对照）；

特殊要求：如 IHC 需荧光双标（同时检测两种蛋白）、ISH 需结合 IHC 进行共定位分析（蛋白与核酸共表达）。

（二）信息要求细则

样本背景信息：需提供样本编号、患者 / 动物信息（如性别、年龄、疾病分期）、样本采集时间与处理流程（如固定液类型、固定时长、是否脱钙），避免因样本处理不当导致检测失败（如固定时间过长导致抗原丢失）；

质量控制要求：若为临床检测，需说明是否需符合 CLIA、ISO 15189 等规范，是否需病理医师签发报告；若为科研检测，需明确是否需技术重复（如≥3 次重复实验）；

特殊样本说明：

骨组织、钙化组织：需提前说明，需额外进行脱钙处理（如 EDTA 脱钙）；

FFPE 组织存放超过 3 年：需评估核酸 / 蛋白保存状态，可能需调整实验条件（如延长抗原修复时间）；

低丰度目标分子（如低表达 mRNA）：需说明，需选择高灵敏度检测方案（如 RNAscope ISH、TSA 信号放大）。

五、交付内容及增值服务

（一）基础交付

完整检测报告：

实验信息：样本信息（编号、类型、处理流程）、检测目标（蛋白 / 核酸名称）、实验方法（IHC/ISH 具体步骤，如抗体克隆号、探针类型、修复方法）、对照设置（阳性 / 阴性对照结果）；

结果数据：

IHC：目标蛋白的表达位置（细胞膜 / 质 / 核）、半定量评分表（如阳性细胞百分比、染色强度、H-score 值）、阴性 / 阳性对照结果；

ISH：目标核酸的信号分布、定量结果（如 FISH 信号比值、阳性细胞比例）、对照样本信号验证结果；

结论与解读：结合病理背景解读结果（如 “PD-L1 表达阳性，阳性细胞百分比 50%，建议考虑 PD-1 抑制剂治疗”“HER2 FISH 比值 2.5，判定为基因扩增”）；

方法学验证：抗体特异性验证（如 Western blot 验证）、探针杂交效率验证（如阳性对照信号强度）。

核心实验文件：

图像文件：高分辨率组织切片图像（IHC 显色图、ISH 荧光图 / 显色图），标注目标分子表达区域（如红色箭头标注 PD-L1 阳性细胞）；

原始数据：IHC 评分原始记录（阳性细胞计数、染色强度评分）、ISH 信号计数表（如 HER2 信号 / 着丝粒信号比值计算过程）；

试剂文件：抗体 / 探针说明书、批次质检报告（如抗体效价、探针杂交效率）、试剂批号与有效期。

样本留存：

剩余样本：未使用的石蜡切片（-20℃保存 1 个月）、剩余抗体 / 探针（按说明书条件保存）；

实验产物：染色后的切片（封片后室温保存 6 个月，荧光切片 - 20℃避光保存 1 个月），便于后续复查。

（二）增值服务

高级检测与分析：

多靶点共定位分析：IHC 双标 / 三标（如同时检测 PD-L1、CD8、Ki-67）、IHC-ISH 共染（如蛋白与 mRNA 共定位），通过共聚焦显微镜获取高分辨率共定位图像，分析目标分子的空间关联（如 PD-L1 + 细胞与 CD8+ T 细胞的邻近关系）；

定量分析：使用图像分析软件（如 ImageJ、HALO）进行定量分析（如 IHC 的 H-score 自动计算、ISH 的信号计数自动化），减少人工判读误差；

大数据分析：对批量样本（如≥100 例肿瘤组织）进行 IHC/ISH 结果统计，结合临床数据（如患者生存期）进行生存分析，筛选预后相关标志物。

技术支持与转化服务：

实验方案定制：针对特殊样本（如低丰度蛋白、罕见病原体）定制检测方案（如优化抗原修复条件、设计特异性探针）；

临床伴随诊断开发：协助开发 IHC/ISH 伴随诊断试剂盒（如 PD-L1 IHC 检测试剂盒、HER2 FISH 试剂盒），进行方法学验证（如灵敏度、特异性、重复性），支持注册申报；

技术培训：提供 IHC/ISH 实验操作培训（样本处理、抗体孵育、探针杂交、结果判读），或图像分析软件（如 HALO）使用培训。

学术与临床支持：

论文支持：按期刊要求优化图像格式（分辨率 300 dpi、标注比例尺），撰写方法学部分与结果解读，协助引用相关抗体 / 探针文献；

临床咨询：提供病理医师咨询服务，解读检测结果的临床意义（如指导靶向治疗方案选择）；

质量控制服务：为实验室提供 IHC/ISH 质量控制方案（如室间质评样本检测、标准化操作流程 SOP 制定）。

六、技术优势

（一）原位保留，关联形态与分子信息

两种技术均在组织细胞原位检测目标分子，保留完整的病理形态学背景（如肿瘤细胞与正常细胞的空间分布、组织架构），可直接关联分子表达与病理表型（如 IHC 检测 PD-L1 在肿瘤浸润免疫细胞中的表达、ISH 检测 HER2 基因扩增在肿瘤灶中的分布），避免匀浆检测（如 Western blot、qPCR）丢失空间信息的局限。

（二）高特异性与灵敏度，适应多样化检测需求

特异性：IHC 依赖抗原 - 抗体的高度特异性结合（交叉反应率＜5%），ISH 依赖核酸探针的碱基互补配对（错配率＜1%），可精准区分同源分子（如 IHC 区分 ERα 与 ERβ、ISH 区分 HPV16 与 HPV18）；

灵敏度：IHC 通过酶促反应或荧光信号放大（如 TSA）可检测低丰度蛋白（如 pg 级）；ISH 通过探针设计（如锁核酸 LNA 探针）与信号放大系统（如 RNAscope 技术），可检测单拷贝 mRNA 或基因片段（如低丰度 microRNA、病毒整合基因），满足临床低表达标志物检测需求（如早期肿瘤微小病灶）。

（三）灵活适配临床与科研场景

临床兼容性：可直接使用临床常规 FFPE 组织样本（无需特殊保存），检测流程符合临床病理规范（如 CLIA、ISO 15189），结果可作为临床诊断与治疗决策的依据（如 PD-L1 IHC 指导免疫治疗、HER2 ISH 指导靶向治疗）；

科研扩展性：支持多靶点联合检测（如 IHC 多标、IHC-ISH 共染）、与其他技术联用（如结合单细胞测序定位特定细胞群的分子表达），满足基础研究中 “分子 - 细胞 - 组织” 多尺度分析需求。

（四）定性与半定量结合，结果可解读性强

IHC 可定性判断蛋白表达位置（膜 / 质 / 核），半定量评分（如阳性细胞百分比、染色强度）；ISH 可定性定位核酸分布，定量分析基因拷贝数（如 FISH 比值）或 mRNA 丰度；结果解读标准明确（如 RECIST 标准、HER2 检测指南），可在不同实验室间复现，且与临床结局（如疗效、预后）直接关联，为转化医学提供可靠桥梁。