一、技术概述

RNA 干扰（RNAi）是通过小 RNA 分子（siRNA 或 shRNA）特异性降解靶基因 mRNA，抑制基因表达的转录后调控技术。siRNA 是短双链 RNA（21-23nt），可直接与靶 mRNA 结合并引发降解，作用快速但持续时间短（3-7 天）；shRNA 是含茎环结构的短发夹 RNA，可通过载体导入细胞后被加工为 siRNA，实现长效干扰（稳定细胞系中可持续数周甚至数月）。该技术具有特异性强、操作简便的特点，是研究基因功能的常用工具，广泛应用于基因沉默验证、信号通路分析及药物靶点筛选。

二、核心应用场景

基因功能研究：通过沉默特定基因，观察细胞表型变化（如增殖、凋亡、迁移、侵袭），反向验证基因的生物学功能。

信号通路解析：沉默通路中关键基因，检测下游分子的表达或活性变化，明确基因在通路中的作用节点。

药物靶点验证：在细胞模型中沉默候选药物靶点基因，评估其对药物敏感性的影响，验证靶点的有效性。

瞬时与长效沉默需求：siRNA 适合短期实验（如急性基因沉默效应观察），shRNA 适合长期实验（如稳定细胞系构建、动物模型干预）。

联合实验应用：与过表达实验结合（如沉默后回补表达），排除脱靶效应，确证基因功能的特异性。

三、实验流程与周期

完整实验流程：靶基因序列分析→siRNA/shRNA 序列设计与筛选→siRNA 化学合成（或 shRNA 载体构建）→转染试剂选择与优化→细胞转染（siRNA 直接转染；shRNA 通过载体转染或病毒包装感染）→转染效率检测→基因沉默效率检测（RT-qPCR 检测 mRNA 水平，Western Blot 检测蛋白水平）→功能表型验证（可选）。

实验周期：

siRNA 瞬时干扰（含沉默效率检测）：7-10 个工作日

shRNA 载体构建 + 瞬时干扰：12-15 个工作日

shRNA 稳定细胞系构建（含药物筛选）：20-25 个工作日

四、客户需提供的样本信息

样本类型：

细胞系：贴壁细胞（≥5×10^5 个）、悬浮细胞（≥1×10^6 个），需处于对数生长期，活力≥90%。

其他：若需构建 shRNA 病毒载体，需提供靶基因详细序列信息（无需细胞样本）。

样本要求细则：

细胞样本：需注明细胞名称、培养条件（培养基类型、血清浓度、抗生素使用情况）及支原体检测结果（确保无感染）；运输时用含 10% FBS 的完全培养基，4℃冷藏（24 小时内送达）。

关键信息：靶基因名称、物种来源（人 / 小鼠 / 大鼠等）、NCBI 登录号（mRNA 序列）；需说明实验目的（瞬时沉默 / 稳定沉默）及是否需要功能验证（如增殖、凋亡检测）。

特殊要求：若客户指定 siRNA/shRNA 序列，需提供序列信息及设计依据；若需沉默多个基因，需注明基因组合及检测优先级。

五、交付内容及增值服务

1. 基础交付：

完整实验报告（含 siRNA/shRNA 序列、转染条件、检测方法及原始数据）。

沉默效率数据：RT-qPCR 结果（靶基因 mRNA 相对表达量，以内参基因校正）、Western Blot 结果（靶蛋白表达水平），并计算沉默效率（通常要求≥70%）。

转染效率证明：若使用荧光标记 siRNA 或含荧光标签的 shRNA 载体，提供荧光显微镜照片或流式细胞术检测结果。

稳定细胞系（若为 shRNA 稳定干扰项目）：2-3 支冻存细胞，附细胞培养说明书及基因型鉴定报告。

2. 增值分析：

剂量效应曲线：测试不同浓度 siRNA 的沉默效率，确定最优使用浓度（减少脱靶效应）。

时间效应曲线：检测转染后不同时间点（如 24h、48h、72h）的沉默效率，确定最佳检测时间点。

功能表型分析：根据客户需求，提供细胞增殖（CCK-8）、凋亡（流式 Annexin V 检测）、迁移（Transwell）等功能实验结果（额外收费）。

六、技术优势

序列设计优化：采用 siRNA 设计算法（如 Dharmacon 算法），避免靶向同源序列或非编码区，优先选择 mRNA 开放阅读框（ORF）区域；设计 3-4 条候选序列，通过预实验筛选沉默效率最高的序列（确保≥70%）。

降低脱靶效应：siRNA 采用化学修饰（如 2'-O - 甲基修饰），减少对非靶标 mRNA 的干扰；shRNA 载体选用 U6/H1 启动子，确保小 RNA 精准转录，降低对细胞内源 miRNA 通路的影响。

转染体系适配：根据细胞类型优化转染方案（如贴壁细胞用脂质体转染，悬浮细胞用电穿孔），对难转染细胞（如原代细胞）采用病毒介导的 shRNA 递送，转染效率可达 80% 以上。

严格质控体系：每批次实验设置阴性对照（无关序列 siRNA/shRNA）、阳性对照（已知高效沉默的基因序列）及空白对照，确保实验体系稳定；通过 RT-qPCR 和 Western Blot 双重验证沉默效率，避免假阴性结果。

七、常见问题（FAQ）

Q：siRNA 和 shRNA 如何选择？

A：短期实验（1-2 周）或需快速验证基因功能，优先选择 siRNA（操作简便、周期短）；长期实验（＞2 周）、需构建稳定模型或动物实验，选择 shRNA（可整合到基因组，持续沉默）。

Q：沉默效率未达预期（＜50%）怎么办？

A：可能因序列设计不佳、转染效率低或靶基因 mRNA 稳定性高导致。我方会免费更换候选序列、优化转染条件（如调整转染试剂比例）或延长作用时间，确保达到理想沉默效果。

Q：如何判断沉默效果是特异性的还是脱靶效应？

A：可通过 “Rescue 实验” 验证：在沉默靶基因的同时，过表达不被 siRNA/shRNA 识别的靶基因突变体（如密码子优化的 cDNA），若表型恢复，则证明沉默效果是特异性的；同时设置阴性对照（无关序列），排除非特异性影响。